陳良妮，程雪梅，陳 勇，王長(zhǎng)虹*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203）

川烏是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的干燥母根,分布于四川、陜西、云南、湖北、湖南、河南等地,以四川江油產(chǎn)者最優(yōu)［1］,其性熱,味苦、辛,略有麻舌感,主歸心、肝、腎、脾經(jīng),具有祛風(fēng)除濕,溫經(jīng)止痛的功效,常用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、寒疝作痛等［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明,該藥材具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保護(hù)心血管等作用,但同時(shí)也有著心臟毒性、神經(jīng)毒性、肝毒性等。其化學(xué)成分主要為二萜生物堿類、季銨鹽類、阿樸啡類、吡咯類等生物堿,以及黃酮、皂苷、神經(jīng)酰胺、多糖等非生物堿［3］,其中二萜生物堿是主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ),既是主要有效成分,也是毒性物質(zhì),而吡咯類、季銨鹽類、阿樸啡類等非二萜類生物堿及其他非生物堿成分在強(qiáng)心、抗炎方面具有較強(qiáng)的生理活性［3］。

為達(dá)到減毒存效的目的,川烏使用前一般需加工炮制,使其中毒性最大的雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等熱水解C8位的乙?；啥拘暂^弱的單酯型生物堿,如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等,或進(jìn)一步熱水解C14位的benzoyl 而生成幾乎無毒性的醇胺型生物堿烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿等［4］。據(jù)報(bào)道,小鼠靜脈注射烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿后,LD50分別為0.12、0.10、0.47 mg/kg,給予苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿后分別為23、21、23 mg/kg,給予烏頭原堿后為120 mg/kg［5］。2015 版《中國(guó)藥典》 收錄了18 副含制川烏的內(nèi)服制劑,在有給藥劑量的12 副中,其劑量范圍為0.019～1.99 g；文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道,成人(60 kg) 口服制川烏提取物后,出現(xiàn)心率減慢的日用限量為1 619.55 mg,可見該藥材臨床治療窗范圍較窄,易產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng),甚至中毒死亡。本文對(duì)川烏藥理、毒性、質(zhì)量控制方法的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述,以期為該藥材深入研究提供參考。

1 藥理作用

川烏主要生物活性為抗炎、鎮(zhèn)痛,臨床主要用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛等,相關(guān)研究集中在烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭原堿等成分,2015年版《中國(guó)藥典》 收錄了32 副含川烏或制川烏的復(fù)方制劑(包含內(nèi)服和外用),其中29 副用于治療風(fēng)濕疼痛。另外,該成分還具有保護(hù)心血管、抗腫瘤等藥理作用。

1.1 抗炎 川烏作為臨床常用抗風(fēng)濕藥,用于治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎等疾病,主要通過抗炎來發(fā)揮作用。有學(xué)者用0.44 g/kg 劑量川烏總堿在致炎前48、24、1 h 處理大鼠,發(fā)現(xiàn)該成分可明顯減少角叉菜引起的炎癥滲出物中PGE 水平,并且對(duì)組胺、五羥色胺引起的足腫脹和毛細(xì)血管通透性增強(qiáng),二甲苯致耳水腫、巴豆油致氣囊腫滲出,以及可逆性被動(dòng)Arthus 反應(yīng)、佐劑關(guān)節(jié)炎等類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎也有明顯抑制作用［7］,其機(jī)制可能與參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有關(guān),苯甲酰烏頭原堿可抑制患者血清TNF-α、IL-1β 分泌,降低VEGF 水平,上調(diào)滑膜Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)［8］。Hikino 等［9］給模型小鼠腦室內(nèi)注射40、80 ng新烏頭堿,發(fā)現(xiàn)該成分對(duì)角叉菜膠引起的足腫脹,醋酸、瓊脂促使的血管通透性均產(chǎn)生劑量依賴性抗炎作用,并通過嗎啡、新烏頭堿對(duì)角叉菜膠所致足腫脹大鼠進(jìn)行治療,證明其抗炎機(jī)制涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

近年來,從分子水平研究川烏抗炎機(jī)制取得了一定進(jìn)展。有學(xué)者以川烏中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿為代表建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)該藥材通過影響前列腺素代謝過程中趨化因子介導(dǎo)的白細(xì)胞趨化來發(fā)揮抗炎作用［10］。Yu等［11］在IL-1β (10 ng/mL) 刺激人滑膜SW982 細(xì)胞前,分別用0、5、10 μmol/L 苯甲酰烏頭原堿孵育SW982 細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8 mRNA 和蛋白表達(dá)被5、10 μmol/L 苯甲酰烏頭原堿抑制,絲裂原活化蛋白激酶的活化和Akt 的磷酸化明顯下降,κB 抑制劑(I-κB) -α 的降解和p65 蛋白的磷酸化和核轉(zhuǎn)位也被抑制,表明苯甲酰烏頭原堿通過絲裂原活化蛋白激酶、AKT 和核因子-κB (NF-κB) 途徑來發(fā)揮抗炎作用,并且在實(shí)驗(yàn)前采用MTT 法檢測(cè)該成分對(duì)SW982 細(xì)胞的潛在細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)其濃度達(dá)到50 μmol/L 時(shí)也無毒性。

1.2 鎮(zhèn)痛 川烏對(duì)慢性炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、急性疼痛、癌癥疼痛有良好的抑制作用,而且不易耐受。Wang 等［12］給雄性ICR 小鼠灌胃制川烏水煎液 (0.34、0.68、1.35 g/kg),每天1 次,連續(xù)7 d,發(fā)現(xiàn)可呈劑量依賴性地減弱慢性炎癥疼痛,并且無耐受性,其機(jī)制可能是增加脊髓內(nèi)強(qiáng)啡肽釋放,激活κ-阿片受體,抑制瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1TRPV1 離子通道。Li 等［13］分別給大鼠鞘內(nèi)注射烏頭堿(1、3、10、30、100 ng)、苯甲酰烏頭原堿(0.3、1、3、10 μg)、烏頭原堿(100、300 μg),發(fā)現(xiàn)烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿可顯著減輕脊髓神經(jīng)結(jié)扎所致神經(jīng)病變的機(jī)械性痛覺過敏和熱痛覺過敏,但烏頭原堿無此作用,其機(jī)制可能是刺激脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)啡肽A 表達(dá)。王華靈等［14］用烏頭堿注射液治療168 例中晚期癌性疼痛患者,發(fā)現(xiàn)總有效率為79.76% (134/168),而且對(duì)消化系統(tǒng)癌痛效果最優(yōu)。孫虎等［15］給小鼠耳外涂抹22.50、18.75、15.00 mg/kg 的烏頭堿藥液,每天1 次,連續(xù)3 d,再腹腔注射0.2 mL 冰醋酸,發(fā)現(xiàn)小鼠潛伏期延長(zhǎng),扭體次數(shù)減少,其鎮(zhèn)痛作用呈劑量依賴性增加,并且當(dāng)劑量達(dá)到18.75 mg/kg 時(shí)出現(xiàn)“平臺(tái)期”。

1.3 保護(hù)心血管 川烏可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和心肌肥大因子來保護(hù)心血管。Bai 等［16］評(píng)估了烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿對(duì)氧化型低密度脂蛋白o(hù)xLDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響,發(fā)現(xiàn)只有次烏頭堿能抑制oxLDL 誘導(dǎo)內(nèi)的皮細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是在劑量24～90 μmol/L 下可促進(jìn)HDAC3 表達(dá),減少HMGB1 胞質(zhì)遷移和胞外釋放。Wang 等［17］采用Western blot 法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(qRT-PCR)、熒光標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)烏頭堿能通過抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ) 所引起的心肌肥大因子ANP、BNP、β-MHC 和F-actin 上調(diào)來緩解心肌肥大和保護(hù)心血管,并且在實(shí)驗(yàn)前通過MTT 法發(fā)現(xiàn)其濃度在5～20 nmol/L時(shí)無明顯細(xì)胞死亡毒性。

1.4 抗腫瘤 川烏可從抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮抗腫瘤作用,具體見表1。

表1 川烏及其主要化學(xué)成分的抗腫瘤作用

1.5 其他 烏頭堿可通過降低原先升高的白細(xì)胞數(shù)、血清抗雙鏈DNA 抗體水平和PGE2、IL-17a、IL-6 水平,以及減少IgG 在腎小球組織中的沉積,從而改善腎組織病理?yè)p害,最終達(dá)到緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病理?yè)p害的作用［22］,并能通過激活P-gp 在LS174T、Caco-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)活性來降低化療藥物對(duì)細(xì)胞的毒性［23］。次烏頭堿可能通過影響大鼠纖溶系統(tǒng)以及VCAM-1、ICAM-1 表達(dá),改善腦梗死的神經(jīng)功能缺損狀態(tài)［24］。苯甲酰烏頭原堿可增加心肌、肝臟、肌肉中線粒體DNA 拷貝數(shù)和OXPHOS 相關(guān)蛋白表達(dá),激活A(yù)MPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可能對(duì)某些與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病有治療作用［25］。

2 毒性

雙酯型二萜生物堿是川烏主要毒性成分,而單酯型二萜生物堿毒性相對(duì)較小(為烏頭堿的1/500～1/50),并具有較好的活性,醇胺型二萜生物堿毒性最低(為烏頭堿的1/4 000～1/2 000),但活性也相對(duì)較弱［4］。該類成分毒性作用有心臟毒性、神經(jīng)毒性、肝毒性、生殖毒性等,其中心臟毒性為研究熱點(diǎn)。

2.1 心臟毒性 心臟毒性是川烏最主要的毒性,可導(dǎo)致嚴(yán)重的心功能紊亂,部分學(xué)者認(rèn)為引起離子通道紊亂是其重要機(jī)制之一,并利用人心肌細(xì)胞、斑馬魚、犬等模型對(duì)其進(jìn)行研究。Wu 等［26］報(bào)道,0.3～3.0 μmol/L 烏頭堿可呈濃度依賴性地縮短人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞的［Ca2+］i瞬變時(shí)間和幅度,使搏動(dòng)頻率增加60%以上,并能顯著降低L 型鈣通道電流(Ica,L),并伴隨激活的正移和失活的負(fù)移,表明L 型鈣通道抑制是烏頭堿致人心肌細(xì)胞心律失常的機(jī)制。Li 等［27］通過研究斑馬魚胚胎和H9c2 細(xì)胞發(fā)現(xiàn),烏頭堿參與鈣信號(hào)通路的調(diào)節(jié),1.5～4.5 μmol/L劑量下能引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子振蕩,增加細(xì)胞凋亡率,抑制TNT、Bcl-2 蛋白表達(dá),促進(jìn)caspase3、Bax 蛋白表達(dá)。Xie等［28］給清醒Beagle 犬口服50、150、450 μg/kg 烏頭堿,發(fā)現(xiàn)QTcV 延長(zhǎng)23%以上,2 h 后出現(xiàn)最大值,并與次烏頭堿血藥濃度呈正相關(guān),同時(shí)進(jìn)行HEK293 細(xì)胞實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該成分可呈濃度依賴性地抑制KCNH2 電流,IC50為8.1 nmol/L,可能是通過抑制KCNH2 (HERG) 鉀通道來介導(dǎo)清醒犬的QT 延長(zhǎng)［29］。另外,對(duì)心臟毒性機(jī)制的研究除了離子通道外,在細(xì)胞酶學(xué)、離子信號(hào)變化、DNA 損傷等方面也取得了一定的進(jìn)展,具體見表2。

表2 川烏及其主要化學(xué)成分的心臟毒性機(jī)制

2.2 神經(jīng)毒性 烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭原堿均有神經(jīng)毒性,能引起運(yùn)動(dòng)阻滯相關(guān)的弛緩性麻痹和死亡,其中烏頭堿TD50、LD50分別為0.3、0.4 μg,苯甲酰烏頭原堿分別為117、142 μg,烏頭原堿分別為757、862 μg［13］。有學(xué)者采用hCMEC/D3 細(xì)胞、小鼠腦灌注模型研究影響川烏生物堿血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的攝取是由質(zhì)膜上表達(dá)的一種質(zhì)子偶聯(lián)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的,并呈溫度、時(shí)間、濃度依賴性,同時(shí)通過RNA干擾分析實(shí)驗(yàn)證明,該逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不是OCTN1,OCTN2、PMAT 這些已知的有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體,還需進(jìn)一步對(duì)該逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行探究［33］。

2.3 其他

2.3.1 遺傳毒性 饒朝龍等［34］發(fā)現(xiàn),烏頭堿促進(jìn)bcl-2 基因的表達(dá)是其損傷細(xì)胞DNA 的重要因素。

2.3.2 肝毒性 Yang 等［35］發(fā)現(xiàn),烏頭堿可抑制p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的磷酸化,mTOR 下游的 p-p70S6K、p-4EBP1同時(shí)降低,最終誘導(dǎo)小鼠肝臟自噬。

2.3.3 生殖毒性 烏頭堿可通過下調(diào)SCA1、Hsd3b1、CYP17a1、Hsd17b3 的表達(dá)來阻斷雄激素的合成,其濃度在50 μmol/L 時(shí)還能誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ROS,增加細(xì)胞凋亡率［36］。

3 質(zhì)量控制方法

3.1 川烏 2015 年版《中國(guó)藥典》 采用HPLC 法,以烏頭堿、新烏頭堿和、次烏頭堿3 種雙酯型二萜生物堿的總含量作為指標(biāo)用于川烏質(zhì)量控制［2］。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,用于川烏藥材飲片質(zhì)量控制的方法可分為色譜技術(shù)、光譜技術(shù)、數(shù)據(jù)分析技術(shù)、其他技術(shù),具體如下。

3.1.1 色譜技術(shù) 色譜技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用十分廣泛,兼?zhèn)浞蛛x和定量的雙重功能,是中藥質(zhì)量控制的有效手段。目前,已有文獻(xiàn)報(bào)道用于川烏質(zhì)量控制的色譜技術(shù)有毛細(xì)管電泳(CE)、高效液相色譜(HPLC)、薄層掃描(TLCS)、液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜(DART-MS)、UHPLC-MS/MS 等,其中HPLC、HPLC-MS較常用,前者可用于常量雙酯型和單酯型二萜生物堿測(cè)定,而后者可用于微量成分、體內(nèi)成分及無紫外吸收的醇氨型二萜生物堿的測(cè)定。

CE 兼具電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn),并具有進(jìn)樣體積小、分離快速、效率高、成本低等特點(diǎn)。韓樂等［37］以40 mmol/L乙酸鈉-60 mmol/L 乙酸銨-80 mmol/L tris 試劑-25%甲醇(pH 8.3) 為緩沖液,在未涂漬標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管(75 μm×64.5 cm,有效長(zhǎng)度56 cm) 上分離檢測(cè)經(jīng)鹽酸-甲醇超聲處理的川烏中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量,發(fā)現(xiàn)6 種生物堿質(zhì)量度與峰面積的線性關(guān)系良好(r＞0.999 7),并且該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高效,可用于該藥材的定量檢測(cè)。

HPLC 是近年來川烏分析中應(yīng)用較廣泛的檢測(cè)方法,具有靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、自動(dòng)化程序高,重復(fù)性好的特點(diǎn)。馬奮剛等［38］以0.1 mol/L 乙酸銨-［乙腈-四氫呋喃(25 ∶15)］ 為流動(dòng)相,測(cè)定經(jīng)過氨試液浸潤(rùn)后用異丙醇-乙酸乙酯(1 ∶1) 超聲處理的12 批生川烏中6 種二萜生物堿含量,發(fā)現(xiàn)單酯型、雙酯性二萜生物堿含量分別為0.031 4%～0.072 4%、0.039 6%～0.190 5%,并且該方法重復(fù)性好,結(jié)果準(zhǔn)確,可簡(jiǎn)便、快速地對(duì)該藥材指標(biāo)性成分定量分析。

LC-MS 是將成分分離與定量分析或定性鑒別相結(jié)合,對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行分析的技術(shù),具有高選擇性、高通量、高靈敏度的特點(diǎn),廣泛用于微量成分和體內(nèi)成分的質(zhì)量控制。Liu 等［5］采用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)、多元模式識(shí)別方法,對(duì)按2015 年版《中國(guó)藥典》 方法炮制前后川烏塊莖中雙酯型二萜生物堿、單酯型二萜生物堿、醇胺型二萜生物堿進(jìn)行了鑒定和比較,發(fā)現(xiàn)炮制后川烏雙酯型二萜生物堿含量降低,單酯二萜生物堿、醇胺二萜生物堿含量升高,可揭示這3 類二萜生物堿之間的轉(zhuǎn)變傳遞變化。

實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜(DART-MS) 技術(shù)是一種能直接電離沒有預(yù)處理的復(fù)雜基質(zhì)樣品的開放式直接離子化技術(shù),讓質(zhì)譜的進(jìn)樣方式變得更簡(jiǎn)便,不需要復(fù)雜的樣品制備和色譜分離步驟,可縮短樣品分析周期,大幅提高分析通量［39］。Zhu 等［40］將DART-MS 法與多變量數(shù)據(jù)分析相結(jié)合,采用LTQ 離子阱質(zhì)譜儀,碰撞能量25～40 eV,在正離子模式下可快速識(shí)別鑒定川烏加工過程中合格品、不合格的化學(xué)標(biāo)志物單酯二萜生物堿、雙酯二萜生物堿,嚴(yán)格控制和評(píng)價(jià)藥材炮制程度,為中藥快速質(zhì)量控制和潛在化學(xué)標(biāo)志物的鑒定提供了可靠的方法。

中藥材指紋圖譜是以整體信息和藥效指標(biāo)為依據(jù),采用一定的分析手段將中藥特征性、有效成分以圖譜的形式描繪出來后建立的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系,具有重復(fù)性、系統(tǒng)性、特征性等特點(diǎn)。Zhu 等［41］建立川烏炮制品超高效液相色譜-電噴霧電離/質(zhì)譜(UPLC-ESI/MS) 指紋圖譜,共鑒定出39 個(gè)特征性TIC 峰和34 個(gè)共有模式UV 色譜峰,9 批樣品的相關(guān)系數(shù)和一致系數(shù)均大于0.96。該方法與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合,可為川烏炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一種靈活可靠的方法。

3.1.2 光譜技術(shù) 以紫外光譜 (UV)、近紅外光譜(NIR) 為代表的光譜技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、無損分析等優(yōu)勢(shì),已有報(bào)道應(yīng)用于川烏的質(zhì)量控制中。

紫外分光光度法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,應(yīng)用廣泛,適用于鑒別、雜質(zhì)檢查、定量測(cè)定。呂定剛等［42］在堿性條件下用乙醇提取制川烏總生物堿,不經(jīng)分離直接采用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法在239、241 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)光譜計(jì)算,測(cè)得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.367%～0.382%,可實(shí)現(xiàn)對(duì)制川烏總生物堿的快速定量分析。

近紅外光譜法(NIR) 是近年興起的一種綠色分析技術(shù),具有低消耗、無污染、非破壞性、高效簡(jiǎn)便等特點(diǎn),目前已較廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制中［43］。涂瑤生等［44］采用NIR 技術(shù),在8 cm-1分辨率的積分球漫反射和10 000～4 000 cm-1的光譜采集范圍內(nèi)測(cè)定放在石英樣品杯中的119 批制川烏粉末雙酯型、單酯型二萜生物堿、水分含量,發(fā)現(xiàn)可準(zhǔn)確測(cè)定。而且,該方法具有分析速度快、不破壞樣品、預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),可用于制川烏中雙酯型、單酯型二萜生物堿和水分含量的預(yù)測(cè)。

3.1.3 數(shù)據(jù)分析技術(shù) 一測(cè)多評(píng)法(QAMS) 是一種對(duì)中藥及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的新方法,它利用樣品中化學(xué)成分的比例關(guān)系,在只測(cè)定1 種成分的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分含量的測(cè)定,適用于參比物質(zhì)不穩(wěn)定、成本高、制備困難的中藥多組分質(zhì)量控制,可顯著降低實(shí)驗(yàn)成本和檢測(cè)時(shí)間［45］。陳洪巖等［46］采用高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-QTOF-MS) 法,以甲醇-水(含0.1%甲酸、2.5 mmol/L 醋酸銨溶液) 為流動(dòng)相,測(cè)定制川烏中烏頭堿含量,并以其為內(nèi)標(biāo)計(jì)算新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿的含量,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與內(nèi)標(biāo)法無明顯差異,表明方法對(duì)川烏的定量測(cè)定準(zhǔn)確可行,并且操作成本低。

多元統(tǒng)計(jì)分析是對(duì)中藥質(zhì)量控制研究中存在一定相關(guān)性的多指標(biāo)、多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,找出隱藏的規(guī)律或數(shù)據(jù)之間的關(guān)系,可為決策服務(wù),從而實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的有效評(píng)價(jià),適用于中藥資源的質(zhì)量評(píng)價(jià)、真?zhèn)舞b別、成分解析等［47］。楊正明等［48］利用UHPLC 法測(cè)定0.05 mol/mL 鹽酸超聲提取的川烏中的生物堿含量,并以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用差異顯著性分析、毒性成分指數(shù)分析、效/毒值分析、主成分分析、聚類熱圖分析、相關(guān)性分析、TOPSIS 分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,評(píng)價(jià)出品質(zhì)最優(yōu)的樣品。

3.1.4 其他 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA) 是一種定性定量檢測(cè)技術(shù),其原理是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與其他顯色反應(yīng)相結(jié)合,可對(duì)微量甚至痕量的成分定量檢測(cè),具有高靈敏度、特異性強(qiáng)、儀器依賴性低、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)［49］。Liu 等［50］利用苯甲酰烏頭原堿免疫原衍生的抗體,可選擇性地與具有酯鍵(14-苯甲?；?) 的苯甲酰烏頭原堿型生物堿結(jié)合,建立測(cè)定單酯型二萜生物堿含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法,可為該類成分提供快速、準(zhǔn)確的特異性檢測(cè)手段。

延遲發(fā)光(DL) 是指受光照射后的長(zhǎng)期超微弱光子發(fā)射衰減現(xiàn)象,它在一定條件下的衰變動(dòng)力學(xué)是反映生物系統(tǒng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)和化學(xué)/生理狀態(tài)的靈敏指標(biāo),廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制中［51］。Sun 等［52］報(bào) 道,高壓滅菌 (127 ℃,60 min) 后川烏粉(150 μm) DL 急劇減少,同時(shí)炮制品其他參數(shù)與生樣品相比有顯著差異(P＜0.05),表明DL 和化學(xué)分析相結(jié)合的方法可用于川烏及其炮制品的質(zhì)量控制。

3.2 含川烏復(fù)方制劑 2015 年版《中國(guó)藥典》 中32 副含川烏復(fù)方制劑有14 副對(duì)川烏進(jìn)行了質(zhì)量控制,具體見表3。

表3 含川烏復(fù)方制劑中川烏的質(zhì)量控制方法。

張劍等［53］利用CE 放大富集技術(shù)對(duì)小活絡(luò)丸中烏頭堿進(jìn)行限量檢測(cè),以60 mmol/L 磷酸二氫鈉(pH=6.0) -乙腈(8 ∶2) 為緩沖液,在非涂漬石英毛細(xì)管 (50 μm×43 cm,有效長(zhǎng)度35 cm) 分離通道上實(shí)現(xiàn)分離和檢測(cè),可將該成分檢測(cè)靈敏度提高了400 倍。鄭來麗等［54］根據(jù)烏頭類總生物堿與溴甲酚綠在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH=3.5) 中形成絡(luò)合物的光譜特征,采用分光光度法,在412.5 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定附桂骨痛復(fù)方中烏頭類總生物堿含量,發(fā)現(xiàn)在10.12～22.77 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 6),平均加樣回收率(n=6) 為99.27%,該方法簡(jiǎn)便易行,專屬性強(qiáng)。有學(xué)者采用HPLC-MS 技術(shù),以甲醇-水(90 ∶10) 為流動(dòng)相,在電噴霧電離源、正離子模式下測(cè)定經(jīng)濃氨試液浸潤(rùn)、乙醚超聲處理后附桂骨痛膠囊中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量,發(fā)現(xiàn)三者分別在0.464～3.944 μg/mL(r=0.999 6)、81.6～816 ng/mL(r=0.999 4)、0.482～6.748 μg/mL (r=0.999 7) 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均加樣回收率(n=6) 分別為98.8%、98.1%、98.4%,可快速、靈敏、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)［55］。張小龍等［56］采用HPLC-QTOF-MS 技術(shù),以甲醇-水(含0.1% 甲酸、2.5 mmol/L 醋酸銨) 為流動(dòng)相,在電噴霧電離源、正離子模式下測(cè)定經(jīng)濃氨試液浸潤(rùn)、乙醚超聲處理后風(fēng)濕骨痛膠囊中雙酯型烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿；單酯型苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿；醇胺型烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿含量,通過一級(jí)質(zhì)譜定量,二級(jí)質(zhì)譜確認(rèn)成分,測(cè)得r均＞0.999 7,加樣回收率在98.1%～101.8%之間。鞏曉宇等［57］采用固相萃取小柱(SPE) 純化經(jīng)甲醇超聲提取后的木瓜丸,在0.1%醋酸銨溶液(冰醋酸調(diào)pH 至3.5) -乙腈(75 ∶25) 流動(dòng)相中通過HPLC 法測(cè)定木瓜丸中的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量,發(fā)現(xiàn)三者分別在3.10～31.0、1.25～12.5、3.24～32.4 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均加樣回收率(n=6) 為98.01%,該方法經(jīng)過SPE 柱純化,能更好地表征該制劑中的微量毒性烏頭類生物堿。

3.3 含烏頭類生物堿生物樣品 研究生物樣品可直觀得到烏頭類生物堿的體內(nèi)暴露量,能更準(zhǔn)確地對(duì)川烏進(jìn)行質(zhì)量控制。Xu 等［58］采用UHPLC-MS/MS 技術(shù)測(cè)定分別灌胃人參皂苷Rg1 配伍的烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭原堿的大鼠血藥濃度,發(fā)現(xiàn)苯甲酰烏頭原堿峰濃度、峰面積顯著增加(P＜0.05),而烏頭堿兩者明顯降低(P＜0.05),而烏頭原堿無明顯變化(P＞0.05),該方法可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出人參皂苷Rg1,可增加苯甲酰烏頭原堿暴露量,減少烏頭堿暴露,而對(duì)烏頭原堿暴露量無明顯影響。Li 等［59］通過UHPLC-HRMS 技術(shù)測(cè)定經(jīng)過分散微固相萃取技術(shù)(DMSPE) 處理后人尿液樣品中烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭原堿含量,測(cè)得檢出限為0.08～0.1 μg/L,定量限為0.2～0.3 μg/L,表明MSPE 與UHPLC-HRMS 結(jié)合應(yīng)用時(shí)可使3 種成分獲得足夠的檢測(cè)水平。Zhang 等［60］采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UHPLC-QQQ-MS) 技術(shù)結(jié)合動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 模式,測(cè)定口服烏頭提取物后大鼠血液中18 種生物堿(包括8 種醇胺型、4 種單酯型、6 種雙酯型二萜生物堿) 含量,發(fā)現(xiàn)烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、10-OH-烏頭堿生物利用度較低,同時(shí)各生物堿在肝、腎中血藥濃度較高,而在腦中僅檢測(cè)到松果堿、新諾啉、苯甲酰脫氧烏頭堿,該方法可以準(zhǔn)確測(cè)定該類成分的體內(nèi)暴露和分布情況。

4 結(jié)語

川烏傳統(tǒng)功效為祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛,主要藥理作用是抗炎鎮(zhèn)痛,同時(shí)越來越多學(xué)者關(guān)注到該藥材抗腫瘤作用,可見其藥理活性廣泛,具有很高的藥用價(jià)值。但它又是大毒中藥,具有心臟毒性、神經(jīng)毒性、肝毒性等,并且治療窗口窄,故要對(duì)其及相關(guān)制劑進(jìn)行嚴(yán)格有效的質(zhì)量控制。

2015 年版《中國(guó)藥典》 收錄了32 副含川烏或制川烏的復(fù)方制劑(包括內(nèi)服和外用),其中22 副以制川烏入藥。川烏經(jīng)過炮制后,雙酯型二萜生物堿含量降低,單酯二萜生物堿、醇胺二萜生物堿含量升高,但醇胺型生物堿無紫外吸收,故單一質(zhì)量控制方法無法達(dá)到全面有效控制該藥材安全性和有效性的。由此建議,應(yīng)建立能體現(xiàn)川烏多組分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)調(diào)作用特點(diǎn)的整體質(zhì)量控制方法,以便于規(guī)范指導(dǎo)該藥材及其相關(guān)制劑的臨床應(yīng)用。