孫彥君 ，陳豪杰，趙 晨，韓瑞杰，陳 輝，郝志友，馮衛(wèi)生*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum的干燥葉,在我國最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,已有二千多年的藥用歷史,具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕功效［1］,臨床上常用于治療骨質(zhì)疏松、絕經(jīng)后綜合征、乳房腫塊、高血壓和冠心?。?-2］,近年來還在抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)骨代謝、提高免疫力、治療艾滋病等方面顯示了獨(dú)特的療效［2］。淫羊藿素是從淫羊藿中分離得到的代表性異戊烯基化黃酮醇類化合物,具有廣泛藥理作用,如抗腫瘤［3］、抗骨質(zhì)疏松和骨骼肌萎縮［4-5］、抗阿爾茨海默病［6］、抗氧化［7］、抗抑郁［8］、調(diào)節(jié)免疫［9］、抗炎［9］、延緩肝纖維化［10］等,并尚未發(fā)現(xiàn)該成分對正常細(xì)胞和組織有明顯的藥物毒性［2,10］,故其開發(fā)前景廣泛,作為治療晚期肝細(xì)胞癌的藥物已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究。本文對近年來關(guān)于淫羊藿素制備方法、制劑新技術(shù)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述,以期為該成分的大量制備及合理開發(fā)利用提供參考。

1 理化性質(zhì)

淫羊藿素別名阿可拉定、淫羊藿苷元,分子式C21H20O6,相對分子質(zhì)量368.126 0,黃色針狀結(jié)晶(甲醇),熔點(diǎn)為228～230 ℃,不溶于水,易溶于DMSO、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,FeCl3、Mg-HCl 反應(yīng)呈陽性。EI-MSm/z(%):368［M］+(100)、353 (80)、325 (10)、312(50)。UV (MeOH) λmaxnm:216sh、250、270、304、368。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:12.38 (1H,s,5-OH),10.76 (1H,s,7-OH),9.49 (1H,s,3-OH),6.30(1H,s,H-6),7.13 (2H,d,J=9.0 Hz,H-3′,5′),8.13(2H,d,J=9.0 Hz,H-2′,6′),3.44 (2H,d,J=6.7 Hz,H-1″),5.18 (1H,t,J=6.7 Hz,H-2″),1.75 (3H,s,H-4″),1.63 (3H,s,H-5″),3.85 (3H,s,3-OCH3)；13CNMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:146.6 (C-2),136.4 (C-3),176.7 (C-4),158.8 (C-5),98.3 (C-6),161.7 (C-7),103.5 (C-8),153.9 (C-9),106.1 (C-10),124.1 (C-1′),129.6 (C-2′),114.6 (C-3′),160.9 (C-4′),114.6 (C-5′),129.6 (C-6′),25.9 (C-1″),122.9 (C-2″),131.5(C-3″),21.7 (C-4″),18.3 (C-5″),55.9 (3-OCH3)［11-13］。

2 提取分離

淫羊藿素主要存在于小檗科植物中,也可見于大戟科、十字花科植物,具體見表1。

淫羊藿素由于在藥材中的含量極低,故一般要采用多種色譜技術(shù)分離才能保證其純度,制備方法復(fù)雜,成本較高,很難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。大花淫羊藿全草粉末(1.2 kg) 采用甲醇提取,提取物經(jīng)反復(fù)ODS、Sephadex LH-20、硅膠等柱色譜分離后,得到淫羊藿素(18.3 mg)［14］。淫羊藿粉末(20 kg) 采用95%乙醇提取,回收乙醇后加水混懸,加入乙酸乙酯萃取,萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜、制備HPLC 分離,得到淫羊藿素(11 mg)［15］。巫山淫羊藿地上部位粉末(2.3 kg) 用95%乙醇提取,提取物依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,其中乙酸乙酯部位經(jīng)聚酰胺柱色譜分離,得到淫羊藿素(36 mg)［11］。箭葉淫羊藿葉粉末(4.0 kg) 用水回流提取,濃縮后提取液經(jīng)HPD 大孔吸附樹脂、硅膠、Sephadex LH-20 等柱色譜結(jié)合制備HPLC 分離,得到淫羊藿素(75.3 mg)［16］。E.elatum的根和地上部位粉末(1.0 kg) 用乙醇提取,提取物經(jīng)硅膠柱色譜、制備HPLC分離,得到淫羊藿素(11.4 mg)［17］。粗毛淫羊藿地上部位粉末(2 kg) 采用95%乙醇提取,回收溶劑后經(jīng)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,乙酸乙酯、正丁醇萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜分離,得到淫羊藿素(30 mg)［18］。M.siamensis枝和葉粉末(3.3 kg) 用二氯甲烷提取,提取物經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20 柱色譜、制備型TLC 分離,得到淫羊藿素(100 mg)［19］。尾葉血桐枝粉末(10 kg) 用90%乙醇提取,提取物經(jīng)乙酸乙酯萃取,萃取物經(jīng)MCI 柱色譜、硅膠柱色譜、制備HPLC 色譜分離,得到淫羊藿素 (3.4 mg)［20］。薺菜地上部位粉末(11 kg) 用70%乙醇提取,提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜、中壓液相色譜、Sephadx LH-20 柱色譜分離,得到淫羊藿素(12.25 mg)［21］。

表1 淫羊藿素植物分布

3 淫羊藿苷或淫羊藿總提取物的水解

與直接從淫羊藿中提取分離相比,水解后再提取分離淫羊藿素時產(chǎn)量高,成本低。淫羊藿含有大量以淫羊藿苷為主的異戊烯基化黃酮苷類化合物,淫羊藿苷結(jié)構(gòu)中含有2 個糖基,分別為7 位的葡萄糖基、3 位的鼠李糖基,經(jīng)去糖基化處理可得到淫羊藿素。從淫羊藿中制備淫羊藿素的思路主要有2 種,一種是先將總黃酮提取出來再水解,水解產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)一步分離得到；另一種是先將淫羊藿苷提取分離出來,再水解得到。目前,通過水解得到淫羊藿素的方法主要有酶水解、酸水解、酸-酶混合法。

3.1 酶水解 酶水解法條件溫和,專屬性強(qiáng),所用到的酶主要有β-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶、柚苷酶、蝸牛酶、果膠酶、纖維素酶等。孟坤［22］發(fā)明了β-葡萄糖苷酶制備淫羊藿素的方法,即采用水煎煮法提取淫羊藿,濃縮后的提取液經(jīng)D101 大孔吸附樹脂,依次用水、30%乙醇、50%乙醇洗脫,收集50%乙醇洗脫液,得到總黃酮提取物,再采用硅膠柱色譜分離,三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,收集含有淫羊藿苷的流份,甲醇重結(jié)晶純化,得到淫羊藿苷,通過β-葡萄糖苷酶酶解脫去糖基,得到淫羊藿素。許明淑等［23］發(fā)明了柚苷酶酶解法,即在淫羊藿苷中加入30%乙醇,再加入1 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 至4.0,加入柚苷酶,在50 ℃下攪拌30 h,得到淫羊藿素。賈曉斌等［24］發(fā)明了蝸牛酶酶解法,即將淫羊藿用30%～95%乙醇或30%～100%甲醇回流提取,回收溶劑,膏狀物中加入pH 3.5～9.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和蝸牛酶,在15～80 ℃下反應(yīng)2～72 h,得到淫羊藿素,重結(jié)晶得到純品。孟坤［25］發(fā)明了果膠酶酶解法,即將淫羊藿提取物在果膠酶的作用下進(jìn)行酶解反應(yīng),得到淫羊藿素。董登祥［26］發(fā)明了纖維素酶酶解法,即將淫羊藿苷溶于醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=4.5),在37 ℃下攪拌15 min,加入纖維素酶酶解過夜,得到淫羊藿素。蕭偉等［27］發(fā)明了一種能降解淫羊藿苷母核結(jié)構(gòu)上鼠李糖殘基的α-L-鼠李糖苷酶和葡萄糖殘基的β-葡萄糖苷酶,通過糖苷酶組合物將淫羊藿苷轉(zhuǎn)變?yōu)橐蜣剿亍Ｚw林果等［28］采用α-L-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶組成的雙酶體系,轉(zhuǎn)化淫羊藿總黃酮(淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)中的多組分黃酮苷而生成淫羊藿素。

3.2 酸水解董登祥［26］將淫羊藿苷在酸性條件下(5 mol/L鹽酸、5 mol/L 硫酸、80%冰醋酸、體積比3 ∶10的5 mol/L 硫酸與80%冰醋酸混合液) 于60 ℃水浴中回流24 h,水解液冷卻后加入NaHCO3溶液調(diào)pH 至6,乙醚萃取,回收溶劑,得到淫羊藿素。孟坤等［29］用乙醇回流提取淫羊藿,提取液經(jīng)HPD-300 大孔吸附樹脂純化,用水、20%乙醇洗脫除去雜質(zhì)后,加70%乙醇洗脫,收集洗脫液,得到含淫羊藿苷的濃縮物,加入四氫呋喃-異丙醇溶液、濃硫酸,在55～62 ℃下水解24 h 后加入5%NaHCO3溶液淬滅,回收有機(jī)溶劑,反應(yīng)液離心,得到沉淀,加入丙酮,在50 ℃下攪拌溶解,濾過,濾液加水升溫到64 ℃至溶液澄清,降溫至10 ℃保溫2 h,收集沉淀,得到淫羊藿素。

3.3 酸解與酶解混合法 參考文獻(xiàn)［30］ 報道。淫羊藿苷先加入5%稀硫酸在50 ℃下水解24 h,得到脫去鼠李糖基的產(chǎn)物淫羊藿次苷I,加入β-葡聚酶,在50 ℃下于0.1 mol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液中酶解20 h,得到淫羊藿素。

淫羊藿苷的酶解反應(yīng)可選用纖維素酶或葡聚糖酶,加入纖維素酶,在37 ℃下于0.1 mol/L 醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH=5) 中水解5～6 d,生成去掉葡萄糖基的淫羊藿次苷Ⅱ、部分淫羊藿次苷Ⅰ的混合物,再加入β-葡聚糖酶,在50 ℃下于0.1 mol/L 醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH=5) 中水解20 h,水解淫羊藿次苷Ⅱ,水解產(chǎn)物加入5% 稀硫酸在50 ℃下水解24 h,得到淫羊藿素。

通過反復(fù)試驗(yàn)證實(shí),淫羊藿苷結(jié)構(gòu)中的7 位葡萄糖苷鍵易被酶水解,而3 位鼠李糖苷鍵易被酸水解。因此,該成分先經(jīng)β-葡聚糖酶水解后再用5%硫酸水解,不僅制備方法簡便,而且收率較高。

4 全合成與結(jié)構(gòu)修飾

牟關(guān)敏等［31］以間苯三酚為原料,合成了淫羊藿素。具體合成過程(圖1) 為間苯三酚與乙腈經(jīng)Houben-Hoesch 反應(yīng),得到乙?；拈g苯三酚(1),再經(jīng)甲氧甲基醚保護(hù)之后得到化合物2,后者與茴香醛在氫氧化鈉、雙氧水的催化下通過一鍋法直接構(gòu)建了黃酮醇母體,即5,7-二-O-(甲氧基甲基) -4′-甲氧基黃酮醇(3),脫除5-位保護(hù)基、引入3-位甲氧基甲基后得到化合物5,在碳酸鉀、冠醚催化下與異戊烯基溴反應(yīng),生成5-O-異戊烯基化產(chǎn)物(6),加入氯苯、催化劑三-(6,6,7,7,8,8,8-七氟-2,2-二甲基-3,5-辛二酮) 銪,在80 ℃下反應(yīng),得到8 位異戊烯基化的化合物7。在鹽酸作用下脫除保護(hù)基,得到淫羊藿素,總收率為4.2%。在整個合成路線中,黃酮醇骨架構(gòu)建和異戊烯基重排是影響總收率的關(guān)鍵步驟,而這兩步反應(yīng)產(chǎn)率的提高則是淫羊藿素全合成路線優(yōu)化的突破點(diǎn)。

圖1 淫羊藿素合成路線（Ⅰ）

Nguyen 等［12］以2,4,6-三羥基苯乙酮和對羥基苯甲酸為原料,合成了淫羊藿素。具體合成過程(圖2) 為2,4,6-三羥基苯乙酮在K2CO3催化下,與BrBn 反應(yīng)生成化合物1,對羥基苯甲酸與硫酸二甲酯先在NaOH 催化下后在SOCl2催化下生成4-甲氧基苯甲酰氯(2),化合物1、2 經(jīng)貝克-文卡塔拉曼(Baker-Venkataraman) 重排反應(yīng)和脫水閉合構(gòu)建黃酮骨架,得到化合物3,與二甲基二環(huán)氧乙烷(DMDO) 反應(yīng)24 h 后再與對甲苯磺酸反應(yīng)2 h,得到黃酮醇骨架,即化合物4,在Pd/C 催化下脫去芐基后再進(jìn)行甲氧甲醚化,得到化合物6,在K2CO3催化下與3,3-二甲基丙烯溴反應(yīng),生成5-O-異戊烯基化產(chǎn)物(7),在N,N-二乙基苯胺催化下得到8 位異戊烯基取代的衍生物(9),在鹽酸催化下脫去保護(hù)基,得到淫羊藿素。

圖2 淫羊藿素合成路線（Ⅱ）

Mei 等［32］以山柰酚為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,得到淫羊藿素。具體合成過程(圖3) 為將山柰酚中的所有羥基乙酰化,得到產(chǎn)物(1),與芐基溴反應(yīng)生成7 位芐醚衍生物(2),在堿性條件下與硫酸二甲酯反應(yīng),得到4′位醚化同時脫去3、5 位乙?；漠a(chǎn)物(3),在N,N-二異丙基乙胺的催化下3 位羥基被甲氧甲醚化,得到產(chǎn)物(4),在碳酸鉀、冠醚的催化下,與異戊烯基溴反應(yīng),生成5-O-異戊烯基化產(chǎn)物(5),加入氯苯、催化劑三-(6,6,7,7,8,8,8-七氟-2,2-二甲基-3,5-辛二酮) 銪,在85 ℃下反應(yīng),得到8 位異戊烯基化的化合物6,在鹽酸作用下脫除3位保護(hù)基,在1,4-環(huán)己二烯、Pb/C 催化化下脫去7 位芐基,得到淫羊藿素。

圖3 淫羊藿素合成路線（Ⅲ）

5 制劑新技術(shù)

淫羊藿素制成軟膠囊后供三期臨床使用,具有保存期長、穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低、適用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［33］,但該成分水溶性、脂溶性均很差,在水中的平衡溶解度僅約為10 μg/mL［34］,在大豆油、C6-C12 脂肪酸甘油酯中的溶解度也分別只有2.858、1.840 mg/mL［35］。另外,淫羊藿素以常規(guī)口服方式給藥后,由于肝臟首過消除效應(yīng)(主要代謝產(chǎn)物為葡萄糖醛酸衍生物［36］) 會降低該成分治療指數(shù),同時胃腸道功能和其內(nèi)容物也會影響其療效的穩(wěn)定性,導(dǎo)致體內(nèi)吸收差,生物利用度低(僅4.33%［36］),制約了其臨床應(yīng)用。為提高淫羊藿素溶解性、穩(wěn)定性、靶向性,增強(qiáng)其藥效,藥學(xué)工作者轉(zhuǎn)向了相關(guān)新劑型的研制開發(fā)。

脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)具有良好的生物相容性,以及毒性小、安全性高、具有緩釋性和靶向性等諸多優(yōu)勢,經(jīng)口服進(jìn)入胃腸道后,可將包埋的水溶性或脂溶性有效成分?jǐn)U散到小腸上皮黏膜細(xì)胞,提高人體對有效成分的吸收能力。為了解決淫羊藿素在水相體系里溶解性差、受外界環(huán)境影響易發(fā)生降解等問題,并提高該成分在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性,袁芳等［37］采用薄膜分散結(jié)合冰浴超聲或者高壓均質(zhì)乳化處理,制備脂質(zhì)體口服制劑；賈曉斌等［38］發(fā)明了一種淫羊藿素脂質(zhì)體的制備方法,由大豆卵磷脂(50%～85%)、膽固醇(10%～35%)、淫羊藿素(2%～25%) 組成,表面為磷脂雙分子層,雙分子層內(nèi)部、外部為親水基團(tuán),雙分子層之間為疏水基團(tuán),淫羊藿素包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中,可促進(jìn)該成分吸收,并且大豆卵磷脂來源廣泛,成本低,具有良好的生物相容性,可生物降解。

利用納米化技術(shù)將淫羊藿素包裹于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中時,可提高了該成分水溶性,同時該劑型物理穩(wěn)定性良好,放置較長時間后未見分層、絮凝,并可選擇性地聚集于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng),給藥后肝臟中藥物濃度增加,能顯著降低對其他臟器和組織的毒性及用量。脂質(zhì)體粉針是固體制劑,可解決普通脂質(zhì)體聚集、沉降、融合、滲漏等的不穩(wěn)定性問題,李君［39］等發(fā)明了具有肝臟靶向性的淫羊藿素脂質(zhì)體粉針,由淫羊藿素 (0.01%～5%)、磷脂(0.05%～8%)、增塑材料(0～8%)、支持劑(0～20%)組成。固體脂質(zhì)納米粒具有和脂質(zhì)體一樣良好的緩控釋作用和生物相容性,同時可減小了聚合物納米材料所帶來的潛在毒性,黃漢［40］等研制的淫羊藿素固體脂質(zhì)納米粒包封率較高,可增強(qiáng)其水溶性和穩(wěn)定性,提高生物利用度。

固體分散體是將藥物以分子、膠態(tài)、微晶或無定形態(tài)分散在某一固態(tài)載體物質(zhì)中形成的分散體,從而改善其溶解度。吳玲［34］將淫羊藿素與載體泊洛沙姆188 混勻,加熱至熔融并攪拌均勻,冷卻,固化,脆化,得到固體分散體,可顯著提高了該成分溶出性能,而且操作簡單,成本低。

磷脂具有一定的親水性和親脂性,藥物與其形成復(fù)合物后能改善前者溶解性,增加在胃腸道中的吸收,提高生物利用度,從而提高療效。賈曉斌等［41］將淫羊藿素磷脂復(fù)合物制成顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、注射劑、丸劑、凍干粉針劑、軟膠囊等劑型；孟坤等［35］將淫羊藿素與磷脂復(fù)合物制成乳液注射劑,可增加該成分脂溶性(與原料藥相比,磷脂復(fù)合物在油中的溶解度提高了2 倍左右) 和化學(xué)穩(wěn)定性,升高血藥濃度。

孟坤等［33］將淫羊藿素制成口服制劑,即為混懸劑的軟膠囊。王新巒等［42］發(fā)明了一種以淫羊藿素為活性成分的生物復(fù)合材料,用藥過程中該成分微球或納米粒從支架材料中持續(xù)釋放,可長期在骨缺損局部保持療效,從而促進(jìn)骨生長。

6 結(jié)語

淫羊藿素藥理作用廣泛,活性高于其他淫羊藿苷元,并且毒副作用小,發(fā)展?jié)摿Υ?但迄今除了抗腫瘤外,對該成分其他活性的研究仍局限于細(xì)胞、動物模型階段,其制備方法及新劑型開發(fā)已成為影響后續(xù)開發(fā)的關(guān)鍵因素。由于淫羊藿素在藥材中含量低,故通過提取、色譜分離得到,但其操作復(fù)雜,成本高；關(guān)于該成分合成的文獻(xiàn)報道也較少［12,31-32］,并且步驟長,總收率低,其中黃酮醇骨架的構(gòu)建、異戊烯基的引入至為關(guān)鍵；關(guān)于水解淫羊藿苷來獲取該成分的文獻(xiàn)報道較多,主要包括酸水解、酶水解。

淫羊藿素水溶性、脂溶性均較差,如何應(yīng)用當(dāng)代制劑新技術(shù)改善該成分口服生物利用度,使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝?、更?qiáng)效的制劑已成為藥劑學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著人們對淫羊藿素藥理作用機(jī)制、制備方法、新劑型開發(fā)的不斷深入探索,該成分有望在抗癌、防癌、防治骨質(zhì)疏松、神經(jīng)保護(hù)等領(lǐng)域得到應(yīng)用,從而造福于人類。