劉瀟雯，呂偉旗，陳偉東，吳春美

(麗水市人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 麗水 323000）

細(xì)葉小檗Berberis poiretiiSchneid.系小檗科小檗屬落葉灌木,其干燥根入藥,俗稱“三顆針”,性寒,味苦,歸肝、胃、大腸經(jīng),具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效,用于濕熱瀉痢、黃疸、濕疹、咽痛目赤、聤耳流膿、癰腫瘡毒等［1］。其干燥根中含有小檗堿、小檗胺、掌葉防己堿和藥根堿等多種生物堿,具有抗心肌缺血、抑菌、鎮(zhèn)痛、降血糖等藥理活性［2-5］。藥用植物由于地理分布、栽培方式、生境因子等不同,導(dǎo)致藥材質(zhì)量參差不齊,影響著臨床用藥療效與安全［6-7］。目前,針對(duì)細(xì)葉小檗的報(bào)道主要集中在果實(shí)化學(xué)成分［8］、制備工藝［9-10］、顯微構(gòu)造［11］與藥理研究［12-13］等,而對(duì)不同產(chǎn)地藥材中鹽酸小檗堿含量測(cè)定鮮有報(bào)道。本研究收集6 省13 個(gè)產(chǎn)地細(xì)葉小檗種質(zhì)資源,建立HPLC 法測(cè)定根中鹽酸小檗堿含量,分析其與生長(zhǎng)性狀、經(jīng)緯度、海拔間的相關(guān)性,并進(jìn)行聚類(lèi)分析,以期為該藥材質(zhì)量控制與優(yōu)良種質(zhì)篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 2019 年9 月至2019 年10 月采集吉林、河北、重慶、湖南、陜西、云南等省市13 個(gè)細(xì)葉小檗新鮮種質(zhì)資源,經(jīng)麗水市人民醫(yī)院吳春美主任藥師鑒定為小檗科落葉灌木細(xì)葉小檗Berberis poiretiiSchneid.,信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器與試劑 600-2998 型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司)；KQ-1500VDB 臺(tái)式超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；XPR 分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；小型多功能粉碎機(jī)(拜杰儀器有限公司)；101-1SB 烘箱(上海向北實(shí)業(yè)有限公司)；鹽酸小檗堿(YZ-110713,北京索萊寶科技有限公司)；色譜乙腈 (美國(guó)Tedia 公司)；其他甲醇等試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.3 方法

1.3.1 生長(zhǎng)性狀考察 每個(gè)產(chǎn)地取細(xì)葉小檗新鮮植株15 株,純水洗凈,用濾紙吸干水分,陰干,用米尺測(cè)量株高、主根長(zhǎng),用電子天平稱量根系鮮重,每株隨機(jī)取3 片葉,用直尺測(cè)量葉長(zhǎng)與葉寬,計(jì)算葉長(zhǎng)寬比=葉長(zhǎng)/葉寬。

1.3.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件 YMC-Pack Polymer C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride

1.3.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品適量,制備質(zhì)量濃度分別為6.5、13、19.5、26、32.5、65 μg/mL 的對(duì)照品溶液,在“1.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸,得回歸方程為Y=196.78X+123.3 (r=0.999 9),表明鹽酸小檗堿在6.5～65 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2.3 樣品含量測(cè)定 將細(xì)葉小檗根系洗凈除去須根,主根切片,65 ℃烘干至恒定質(zhì)量,粉碎過(guò)60 目篩。精密稱取粉末0.1 g 至50 mL 圓底燒瓶中,加20 mL 甲醇,封口,稱定質(zhì)量,室溫下超聲(250 W,40 kHz) 提取1 h,放冷,甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,抽濾,濾液定容至25 mL 棕色量瓶中,即得供試品溶液。在“1.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定樣品峰面積,平行3 次。

1.3.2.4 精密度試驗(yàn) 取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,在“1.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積,試驗(yàn)平行6 次,測(cè)得峰面積RSD 為0.87%,表明儀器精密度良好。

1.3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取陜西周至樣品,按“1.3.2.3” 項(xiàng)下方法 制備供試品溶液,在“1.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下,分別于室溫遮光放置0、2、4、8、10、12、24 h 后進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,測(cè)得峰面積RSD 為1.39%,表明供試品溶液在室溫遮光條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取陜西周至樣品6 份,按“1.3.2.3” 項(xiàng)下方法 制備供試品溶液,在“1.3.2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積,測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿平均含量為7.84 mg/g,RSD 為2.32%,表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的陜西周至樣品適量,加入鹽酸小檗堿對(duì)照品,在“1.3.2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,測(cè)定樣品含量,計(jì)算加樣回收率,試驗(yàn)平行3 次,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of recovery tests for berberine hydrochloride （n=3）

1.4 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 23.0 與Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用單因素ANOVA 分析,聚類(lèi)分析采用組間聯(lián)接法［14］。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性狀 13 個(gè)產(chǎn)地細(xì)葉小檗生長(zhǎng)性狀存在差異(*P＜0.05 或**P＜0.01),根長(zhǎng)與根重變幅分別為0.84～1.43 m 與24.63～45.89 g,其中湖南藍(lán)山細(xì)葉小檗根長(zhǎng)、根重、株高、葉寬指標(biāo)數(shù)值最大,分別為1.43 m、45.89 g、2.04 m 與1.18 cm,其葉片最為寬鈍,葉長(zhǎng)寬比最低,僅為2.81；湖南雨花細(xì)葉小檗葉片最長(zhǎng),葉長(zhǎng)達(dá)3.48 cm,河北涿鹿細(xì)葉小檗葉片最為狹長(zhǎng),葉長(zhǎng)寬比為4.12,見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地樣品生長(zhǎng)性狀與鹽酸小檗堿含量比較（n=15）Tab.3 Comparison of growth traits and berberine hydrochloride contents of samples from different growing areas（n=15）

2.2 鹽酸小檗堿含量 13 個(gè)產(chǎn)地細(xì)葉小檗中鹽酸小檗堿含量存在差異 (P＜0.01),平均含量為9.45 mg/g,變幅為6.24～12.93 mg/g。從鹽酸小檗堿含量看,13 個(gè)產(chǎn)地鹽酸小檗堿含量均滿足2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定不低于6 mg/g 的標(biāo)準(zhǔn),表明供試細(xì)葉小檗藥材質(zhì)量良好。13 個(gè)產(chǎn)地中,吉林與河北樣品鹽酸小檗堿含量較高,重慶與湖南樣品含量次之,陜西與云南樣品含量較低,其中吉林東昌含量最高,達(dá)12.93 mg/g,是其他樣品的1.07～2.07 倍,而云南宜良樣品含量最低,僅為6.24 mg/g,見(jiàn)表3。

2.3 相關(guān)性分析 鹽酸小檗堿含量與生長(zhǎng)性狀、經(jīng)緯度、海拔關(guān)系密切,與葉長(zhǎng)寬比、經(jīng)度、緯度呈正相關(guān)關(guān)系,其中經(jīng)度正相關(guān)系數(shù)最高,達(dá)0.894 4,而與根長(zhǎng)、根重、株高、葉長(zhǎng)、葉寬、海拔呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,其中海拔負(fù)相關(guān)系數(shù)最高,為-0.650 3。結(jié)果顯示,在供試經(jīng)緯度與海拔范圍內(nèi),高經(jīng)緯度、低海拔種植細(xì)葉小檗有利于其根中鹽酸小檗堿含量積累,而通過(guò)生長(zhǎng)性狀篩選高鹽酸小檗堿含量的細(xì)葉小檗優(yōu)良品系時(shí),可優(yōu)先在葉片狹長(zhǎng)(高葉長(zhǎng)寬比) 的矮狀株系中選擇,見(jiàn)表4。

表4 鹽酸小檗堿含量與生長(zhǎng)性狀、生境因子間的相關(guān)性Tab.4 Correlation analysis between berberine hydrochloride contents and growth traits and habitat factors

2.4 聚類(lèi)分析 以鹽酸小檗堿與生長(zhǎng)性狀為劃分依據(jù),按歐式距離D2=16.97 的標(biāo)準(zhǔn)將13 個(gè)產(chǎn)地細(xì)葉小檗劃分為3 個(gè)類(lèi)群,見(jiàn)圖2。第Ⅰ類(lèi)群共5個(gè)種質(zhì),分別為吉林磐石、河北撫寧、吉林東昌、河北涿鹿、河北赤城,此類(lèi)群細(xì)葉小檗植株較矮,根系不發(fā)達(dá),根產(chǎn)量低,葉片小而狹長(zhǎng),根中鹽酸小檗堿含量高；第Ⅱ類(lèi)群共4 個(gè)種質(zhì),分別為重慶南川、重慶北碚、陜西周至與陜西漢陰,此類(lèi)群細(xì)葉小檗植株中等高度,根系不發(fā)達(dá),根產(chǎn)量低,葉片中等大小,葉型較寬鈍,根中鹽酸小檗堿含量較低；第Ⅲ類(lèi)群共4 個(gè)種質(zhì),分別為云南宜良、云南西山、湖南雨花與湖南藍(lán)山,此類(lèi)群細(xì)葉小檗植株較高,根系發(fā)達(dá),根產(chǎn)量高,葉片多大而寬鈍,其中湖南種質(zhì)鹽酸小檗堿含量中等,但云南種質(zhì)鹽酸小檗堿含量較低。

圖2 13 批樣品聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.2 Dendrogram of thirteen batches of samples

3 結(jié)論與討論

鹽酸小檗堿是2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的細(xì)葉小檗主要質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),具有抗菌消炎、清熱解毒、鎮(zhèn)痛等功效［15］。本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑(甲醇、95%甲醇、乙醇)、提取方法(超聲、索式提取、加熱回流)、提取時(shí)間(40、60、80 min)、流動(dòng)相(乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀) 及檢測(cè)波長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑,室溫下超聲(250 W,40 kHz) 1 h 即可提取完全。結(jié)果表明,6 省13 個(gè)產(chǎn)地細(xì)葉小檗中鹽酸小檗堿含量存在差異(P＜0.01),其中吉林與河北樣品含量最高,陜西與云南樣品含量最低；經(jīng)度、緯度、海拔、株高與鹽酸小檗堿含量關(guān)系密切,在供試經(jīng)緯度與海拔范圍內(nèi),高經(jīng)緯度、低海拔種植細(xì)葉小檗有利于其根中鹽酸小檗堿含量積累,從鹽酸小檗堿含量看,細(xì)葉小檗優(yōu)良種質(zhì)可優(yōu)先在高經(jīng)緯度、低海拔地區(qū)的吉林、河北種質(zhì)中選擇,而從根產(chǎn)量看,可優(yōu)先在云南與湖南種質(zhì)中選擇。藥用植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受諸多環(huán)境因素影響,而各環(huán)境因素間往往具有關(guān)聯(lián)性［16］,本研究將進(jìn)一步開(kāi)展不同種質(zhì)在同一區(qū)域(不同海拔) 栽培試驗(yàn),以期選育出高品質(zhì)、高產(chǎn)量的細(xì)葉小檗優(yōu)良品系。除鹽酸小檗堿外,細(xì)葉小檗中巴馬汀、小檗胺、β-谷甾醇也具有抗菌、抗腫瘤等活性［17-18］,故在細(xì)葉小檗藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立中應(yīng)綜合考慮上述成分。此外,每個(gè)產(chǎn)地只取了1～2 份樣品,區(qū)域代表性不強(qiáng),其他分布區(qū)(如貴州、廣西等地) 未收集到種質(zhì),后續(xù)將加強(qiáng)對(duì)上述產(chǎn)地種質(zhì)資源收集,以期完善種質(zhì)資源庫(kù),為優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。