張倩倩，周 靖，徐云輝，韓妮娜，張志強(qiáng)，華茉莉*

(1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203；2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203；3.北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301）

吳茱萸為歷代本草記載的常用藥味,藥材的植物資源在我國(guó)分布較為廣泛,秦嶺以南區(qū)域多有野生或栽培。2020 年版《中國(guó)藥典》 吳茱萸藥材的質(zhì)量檢驗(yàn)項(xiàng),包括吳茱萸堿、吳茱萸次堿的薄層色譜鑒別,以及吳茱萸堿、吳茱萸次堿與檸檬苦素的含量測(cè)定［1］。本課題組前期研究表明,不同產(chǎn)地吳茱萸藥材中吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量差異懸殊,高低相差超過(guò)20 倍,且與品種和產(chǎn)地沒(méi)有呈現(xiàn)明顯相關(guān),已有相關(guān)報(bào)道也有相似研究結(jié)論［2-4］。中藥材質(zhì)量受植物品種以及生長(zhǎng)環(huán)境影響較大,但歸根結(jié)底是與其所含藥效物質(zhì)組分密切相關(guān)。因此,本研究尋找不同產(chǎn)地吳茱萸藥材的質(zhì)量標(biāo)記物,對(duì)于客觀評(píng)價(jià)吳茱萸藥材質(zhì)量,顯得尤為必要。

本研究收集的46 批樣品,來(lái)自不同產(chǎn)地。采用中藥材DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行分子鑒定,并與《中國(guó)藥典》 DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)比對(duì),確認(rèn)均為正品吳茱萸。然后,建立UPLC 指紋圖譜并進(jìn)行方法學(xué)考察,確定不同產(chǎn)地46 批樣品的共有組分；采用UPLC-Q-TOF-MSE 技術(shù)結(jié)合UNIFI 天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)軟件分析,并與部分化學(xué)對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì),對(duì)以上共有組分進(jìn)行指認(rèn)；在此基礎(chǔ)上,結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析與偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量方法從共有組分中篩選出可能與產(chǎn)地相關(guān)的差異成分。以不同產(chǎn)地吳茱萸藥材的共有組分及其差異成分作為質(zhì)量相關(guān)標(biāo)記物,以期為進(jìn)一步完善現(xiàn)行吳茱萸藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供參考。

1 材料

Waters AcquityTMUPLC 色譜儀串聯(lián)Xevo G2-XS Q-TO 質(zhì)譜儀、Waters Acquity H-Class UPLC 色譜儀(美國(guó)Waters 公司)；Milli-Q 超純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司)；FSJ-A03D1 型中藥粉碎機(jī)(廣東順德小熊電器有限公司)；KQ-250 超聲清洗儀(昆山舒美超聲儀器有限公司)。

甲酸 (LC-MS 級(jí),美國(guó)Fisher 公司)；乙腈(LC-MS 級(jí),上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；亮氨酸腦啡肽(LC-MS 級(jí),美國(guó)Sigma 公司)；超純水,其他試劑均為分析純。吳茱萸堿 (批號(hào)110802-201710)、吳茱萸次 堿 (批 號(hào) 110801-201608)、檸檬苦素(批號(hào)110800-201707) 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸(批 號(hào) ST06230120)、隱綠原酸 (批 號(hào)ST07850120)、水仙苷(批號(hào)ST10940120) 對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德有限公司；二氫吳茱萸新堿(批號(hào)vkq-01575)、金絲桃苷(批號(hào)vkq-00309)、去氫吳茱萸堿(批號(hào)vkq-01235)、綠原酸(批號(hào)vkq-00358) 對(duì)照品均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司。

不同產(chǎn)地46 批吳茱萸藥材,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司定點(diǎn)采購(gòu),信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA 條形碼鑒定 采用植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305,天根生化科技有限公司) 進(jìn)行各批樣品DNA 提取,參照《中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則》 進(jìn)行ITS2 序列的PCR 擴(kuò)增［5］,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采取1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。委托賽默飛世爾科技有限公司對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化和測(cè)序。46 批吳茱萸的DNA 序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù),同時(shí)上傳至中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng) (http://www.tcmbarcode.cn/china/？optionid=176) 進(jìn)行比對(duì),均為正品吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.,各批藥材GenBank 登錄號(hào)見(jiàn)表1。

2.2 UPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 供試品溶液制備 取各批吳茱萸藥材樣品,粉碎,過(guò)40 目篩0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,浸泡1 h,超聲提取40 min,取出,放冷,再次稱定質(zhì)量,用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、新綠原酸、隱綠原酸、水仙苷、二氫吳茱萸新堿、去氫吳茱萸堿、金絲桃苷、綠原酸各對(duì)照品適量,分別加甲醇溶解,制成1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),分別加甲醇稀釋至適宜濃度。

2.2.3 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%三氟乙酸水(B),梯度洗脫(0～3 min,10%A；3～15 min,10%～30% A；15～30 min,30%～100%A；30～35 min,100%～10% A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；進(jìn)樣量5 μL,記錄液相色譜圖。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 取吳茱萸(S28) 供試品溶液,在“2.2.3” 項(xiàng)條件下,連續(xù)進(jìn)樣6 次,記錄色譜圖,以吳茱萸堿為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD 分別小于0.5%、2.9%,表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取吳茱萸(S28) 供試品溶液,在“2.2.3” 項(xiàng)條件下,分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣,記錄色譜圖。以吳茱萸堿為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 分別小于1.5%、2.9%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取吳茱萸(S28) 粉末,按“2.2.1” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,記錄色譜圖。以吳茱萸堿為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.7%、5.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 指紋圖譜結(jié)果分析

2.2.5.1 共有峰確定 將以上46 批樣品UPLC 色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)” (2012A 版),由此得到吳茱萸藥材的UPLC 指紋圖譜疊加圖,見(jiàn)圖1,對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖2。以吳茱萸藥材中主要質(zhì)量指標(biāo)成分吳茱萸堿作為指紋圖譜的參比峰,確定不同產(chǎn)地吳茱萸藥材有31個(gè)共有峰,已確認(rèn)的共有峰與參比峰的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表3。46 批藥材的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.8%,重復(fù)性好。

圖1 46 批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of forty-six batches of samples

圖2 46 批樣品對(duì)照?qǐng)D譜Fig.2 Control fingerprint spectrum of forty-six batches of samples

2.2.5.2 相似度分析 對(duì)46 批各共有峰與吳茱萸堿參比峰的相對(duì)峰面積的分析結(jié)果顯示,RSD 分別為18.24%～89.73%不等,表明不同產(chǎn)地藥材中一些共有成分的含量波動(dòng)較大。

將46 批吳茱萸藥材指紋圖譜與對(duì)照色譜圖進(jìn)行相似度分析,結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地樣品的相似度在0.69～0.99 之間,表明采用指紋圖譜的相似度分析不宜作為吳茱萸藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。研究中廣西和貴州兩地樣品的UPLC 指紋圖譜相似度均大于0.9,呈現(xiàn)一定的產(chǎn)地相似度,是否由此可研究建立不同產(chǎn)地區(qū)分方法,還需積累更多研究數(shù)據(jù)才能定論。

表2 46 批樣品相似度Tab.2 Similarities of forty-six batches of samples

2.2.5.3 聚類(lèi)分析 為了研究46 批吳茱萸產(chǎn)地與質(zhì)量關(guān)系,采用SIMCA14.1 軟件中對(duì)共有峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)4 個(gè)產(chǎn)地的樣品進(jìn)行層序聚類(lèi)分析,聚類(lèi)方法為Ward 離差平方和。系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)表明,46 批樣品聚類(lèi)趨勢(shì)可分為3 大類(lèi),貴州的9 批、湖南和江西各1 批(S25～S33、S24、S5)為第一類(lèi),廣西產(chǎn)地的12 批吳茱萸(S34～S35,S37～S44) 聚為第二類(lèi),江西的15 批、湖南的7批和廣西的1 批(S1～S4、S6～23、S36) 的樣品可聚為第三類(lèi)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 46 批樣品聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.3 Dendrogram of forty-six batches of samples

圖4 偏最小二乘-判別分析變量重要性投影圖Fig.4 VIp scores of partial least squares discrimination analysis

2.2.5.4 偏最小二乘-判別分析 為了進(jìn)一步探究不同產(chǎn)地樣品的差異性,對(duì)46 批樣品的31 種共有組分采用偏最小二乘-判別分析模型進(jìn)行擬合分析(SIMCA14.1 軟件)。模型參數(shù)為R2X=0.755,R2Y=0.864,Q2=0.836,表明模型的準(zhǔn)確性與可預(yù)測(cè)性良好。圖4 為變量重要性投影圖,表明各個(gè)變量對(duì)于區(qū)分3 個(gè)類(lèi)別的吳茱萸藥材的貢獻(xiàn)程度。一般認(rèn)為,VIP 值大于1 的變量存在顯著性差異,貢獻(xiàn)程度較高,以此為標(biāo)準(zhǔn),由此篩選出13 種差異性成分,分別為峰13 (水仙苷)、峰24 ［1-甲基-2-癸基-4 (1H) -喹諾酮/1-甲基-2-十一烷基-4-喹諾酮］、峰25、峰20 (1-甲基-2-壬 基-4-喹諾酮)、峰9 (檸檬黃素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、峰5、峰19 (吳茱萸次堿)、峰23、峰21 ［1-甲基-2-［(Z) -6-十一烯基］ -4-喹諾酮］、峰22 ［1-甲基-2-壬基-4 (1H) -喹諾酮］、峰26、峰29 (吳茱萸新堿) 和峰14 (去氫吳茱萸堿)。

2.3 UPLC-Q-TOF-MSE 鑒定共有峰

2.3.1 鑒定方法 液相色譜系統(tǒng)同“2.2.3” 項(xiàng)下,將流動(dòng)相中0.1% 三氟乙酸水溶液替換為0.1%甲酸水溶液。電噴霧離子源,正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500；氮?dú)怏w積流量500 L/h,溫度40 0 ℃；電離源溫度120 ℃；錐孔氣體積流量100 L/h,電壓40 V；毛細(xì)管電壓3 500 V。在MSE模式下,碰撞低能6 eV,碰撞高能25～60 eV。亮氨酸腦啡肽溶液(0.2 ng/mL) 作為外標(biāo)溶液對(duì)質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)校正,校正離子在正離子模式下m/z556.277 1 ［M+H］+。

分別精密吸取“2.2.1” “2.2.2” 項(xiàng)下吳茱萸(S28) 供試品溶液、各對(duì)照品溶液各2 μL,注入U(xiǎn)PLC-QTOF/MS 儀器分析,得到吳茱萸樣品總離子流圖,見(jiàn)圖5。

圖5 吳茱萸樣品總離子流圖（正離子模式）Fig.5 Total ion current chromatogram of E.rutaecarpa （positive ion mode）

2.3.2 共有峰推導(dǎo)與指認(rèn) 利用UNIFI 中自建的吳茱萸藥材化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩查、鑒定,過(guò)濾掉精確質(zhì)量數(shù)誤差大于10-5的數(shù)據(jù),得到初步的化合物鑒定結(jié)果；結(jié)合各化合物特征離子的精確質(zhì)量數(shù)、相對(duì)保留時(shí)間、分子式、對(duì)照品信息以及相關(guān)文獻(xiàn)［6-10］,對(duì)UPLC 指紋圖譜中31 個(gè)共有峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)。初步確認(rèn)21 種共有組分,包括3 個(gè)有機(jī)酸、4 個(gè)黃酮苷和14 個(gè)生物堿類(lèi)化合物。其中,10 種共有組分經(jīng)對(duì)照品比對(duì),分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、水仙苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿?！?.2.5.4” 項(xiàng)下篩選出的13 種差異成分,共推導(dǎo)確認(rèn)9 個(gè),見(jiàn)表3。

表3 吳茱萸指紋圖譜共有峰鑒定Tab.3 Identification of common peaks from E.rutaecarpa fingerprints

3 討論

本研究建立的吳茱萸藥材UPLC 指紋圖譜方法,可較好實(shí)現(xiàn)藥材中各組分的良好分離,且分析時(shí)間較短,方法學(xué)考察結(jié)果顯示其穩(wěn)定可靠。結(jié)合指紋圖譜的共有峰分析,顯示不同產(chǎn)地樣品的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定,重現(xiàn)性好；但相對(duì)峰面積波動(dòng)較大,提示共有峰存在明顯差異,可能與不同產(chǎn)地藥材的質(zhì)量相關(guān)。

開(kāi)展不同產(chǎn)地樣品指紋圖譜的共有峰分析,共呈現(xiàn)31 個(gè)共有峰,采用UPLC-Q-TOF-MSE 結(jié)合UNIFI 軟件對(duì)其中21 種共有成分進(jìn)行快速表征鑒別,包含生物堿類(lèi)成分14 種、黃酮苷類(lèi)4 種、有機(jī)酸類(lèi)3 種。同時(shí),采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析不同產(chǎn)地樣品的共有成分,從中篩選出13 種差異化成分,已初步鑒定出9 種,分別為水仙苷、1-甲基-2-癸基-4 (1H) -喹諾酮/1-甲基-2-十一烷基-4-喹諾酮、1-甲基-2-壬基-4-喹諾酮、檸檬黃素-3-O-β-D-葡萄糖苷、吳茱萸次堿、1-甲基-2-［(Z) -6-十一烯基］ -4-喹諾酮、1-甲基-2-壬基-4 (1H) -喹諾酮、吳茱萸新堿、去氫吳茱萸堿。

已有研究表明,本研究篩選出的差異化成分與吳茱萸的生物活性存在明顯相關(guān),檸檬黃素-3-Oβ-D-葡萄糖苷和吳茱萸次堿是吳茱萸湯治療偏頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［11］；吳茱萸新堿、去氫吳茱萸堿具有降壓和舒張血管的藥理作用［12］；多種吳茱萸喹諾酮類(lèi)生物堿具有抗血管生成及抗菌活性［13-18］。因此,這些差異化組分可一定程度表征吳茱萸藥效活性差異,可考慮作為吳茱萸藥材的質(zhì)量標(biāo)記物。

綜上所述,建立吳茱萸藥材的指紋圖譜,結(jié)合共有組分及其差異化成分的質(zhì)量標(biāo)記物分析,以期為吳茱萸藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更豐富信息,為進(jìn)一步完善現(xiàn)行《中國(guó)藥典》 吳茱萸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。