劉元林，龍 鳴，張 希，田曉靜，2*，柏家林，2，宋 禮

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；4.甘南牦牛乳研究院，甘肅 合作 747000）

五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 主要生長(zhǎng)于濕潤(rùn)陰涼、溫差小的環(huán)境中,在我國(guó)云南、廣西、四川等地均有種植,其中云南省文山州三七質(zhì)量最好,是其道地產(chǎn)區(qū)［1］。三七具有散瘀止血、消腫定痛、補(bǔ)益氣血、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［2］。三七主根、支根和根莖的有效成分含量也存在一定差異［3］。因此不同產(chǎn)地、不同部位三七價(jià)格上存在較大差異,不法商販為獲得較高利益,往往以其他產(chǎn)區(qū)冒充道地產(chǎn)地三七、以支根和根莖三七粉冒充主根三七粉。因此,鑒別不同部位、不同產(chǎn)地的三七特征可以為三七質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。目前用于三七產(chǎn)地區(qū)分的方法有傅里葉變換紅外光譜［4-5］、核磁共振指紋圖譜［6］、紫外指紋圖譜技術(shù)［7］。

電子鼻技術(shù)可以將氣味成為可量化的指標(biāo),在食品工業(yè)、醫(yī)療工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、中藥質(zhì)量控制等方面有著廣泛應(yīng)用［8-9］,如區(qū)分紫蘇［10］、人參［11］與高良姜［12］品種；判別當(dāng)歸［13］、南五味子［14］產(chǎn)地；應(yīng)用于鹿茸片［15］、藏紅花［16］、枸杞子［17-18］品質(zhì)評(píng)估等方面。三七具有獨(dú)特氣味,適合于電子鼻的檢測(cè),且檢測(cè)過(guò)程不需要添加任何試劑,Yang等［19-20］運(yùn)用電子鼻對(duì)三七摻假與品質(zhì)鑒別進(jìn)行研究；汪萌等［21］研究表明通過(guò)氣味識(shí)別法可區(qū)分不同等級(jí)云南三七。本研究采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化電子鼻檢測(cè)條件,結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)與多層感知器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析,研究運(yùn)用電子鼻判別三七主根、支根及產(chǎn)地的可行性,以期為三七品質(zhì)市場(chǎng)監(jiān)控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與前處理 所用三七樣品于2017 年11月采集云南4 個(gè)不同地區(qū),每個(gè)產(chǎn)地采集40～50顆。樣品經(jīng)干制后,分別將每個(gè)產(chǎn)地的主根和支根粉碎后過(guò)60 目篩,密封保存于4 ℃冰箱待用。將樣品恢復(fù)至室溫后,進(jìn)行電子鼻檢測(cè)。信息見(jiàn)表1,其中羅平產(chǎn)三七用于電子鼻檢測(cè)條件優(yōu)化,丘北、個(gè)舊、沾益三七用于主根、支根及產(chǎn)地判別研究。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 儀器 實(shí)驗(yàn)采用德國(guó)Airsense 公司的PEN3型便攜式電子鼻進(jìn)行檢測(cè),該設(shè)備包括氣體傳感器陣列(表2)、模式識(shí)別系統(tǒng)、信號(hào)處理系統(tǒng)3 個(gè)部分。

表2 電子鼻傳感器陣列與性能特點(diǎn)Tab.2 E-nose sensor array and performance characteristics

1.3 因素水平確定 受樣品量、頂空生成時(shí)間、頂空體積和載氣體積流量等因素影響,頂空揮發(fā)物濃度會(huì)發(fā)生變化,從而影響傳感器響應(yīng)信號(hào)。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)研究樣品量、頂空生成時(shí)間、頂空體積和載氣體積流量4 個(gè)因素對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響,因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。此外,電子鼻清洗時(shí)間設(shè)置為80 s、采樣時(shí)間為90 s。樣品檢測(cè)過(guò)程中,每種樣品均隨機(jī)稱(chēng)取36 個(gè)重復(fù)樣品分析其氣味信息。數(shù)據(jù)分析時(shí),為避免樣品氣味信息的干擾,將電子鼻適應(yīng)過(guò)程的前3 個(gè)樣品氣味信息剔除后,提取傳感器第89 s 響應(yīng)信號(hào)值進(jìn)行分析。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用單因素方差分析研究樣品量、頂空生成時(shí)間、頂空體積和載氣體積流量對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)的影響,結(jié)合典則判別分析獲得較佳檢測(cè)條件。采用主成分分析和典則判別分析對(duì)三七主根、支根及產(chǎn)地進(jìn)行定性分析；采用多層感知器(Multilayer Perceptron,MLP) 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)三七主根、支根及產(chǎn)地進(jìn)行定量分析。方差分析、主成分分析和典則判別分析均由SAS (V8) 完成；MLP分析由SPSS (V17) 完成；結(jié)果由Origin8.0 軟件完成繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻檢測(cè)條件 采用單因素試驗(yàn)研究樣品量、頂空生成時(shí)間、頂空體積和載氣體積流量對(duì)電子鼻10 個(gè)傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。提取傳感器第89 s 的響應(yīng)值,利用SAS (V8) 進(jìn)行單因素方差分析,得到4 個(gè)因素對(duì)電子鼻各個(gè)傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響,見(jiàn)表4。采用典則判別分析對(duì)4 個(gè)因素不同水平的結(jié)果進(jìn)行分析,以數(shù)據(jù)點(diǎn)的聚集性和對(duì)樣品的區(qū)分效果來(lái)確定較佳檢測(cè)條件。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.1.1 樣品量 在頂空體積250 mL,頂空生成時(shí)間10 min、載氣體積流量300 mL/min,清洗時(shí)間80 s,采樣時(shí)間90 s 條件下,研究三七樣品量(0.5、1、1.5 g) 對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。方差結(jié)果表明樣品量對(duì)傳感器S4、S5 影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),對(duì)其余8 個(gè)傳感器響應(yīng)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。典則判別分析表明成分1 占92.21%,成分2 占7.79%,反映出全部的原始信息,見(jiàn)圖1。不同樣品量數(shù)據(jù)點(diǎn)彼此有重疊,但規(guī)律性分布明顯,沿成分1 增大的方向,樣品量逐漸增大；樣品量為1.5 g 時(shí)較0.5、1.0 g 時(shí)的數(shù)據(jù)點(diǎn)更為聚集。

2.1.2 頂空生成時(shí)間 在三七樣品量1.5 g,樣品頂空體積250 mL、載氣體積流量300 mL/min、清洗時(shí)間80 s、采樣時(shí)間90 s 條件下,研究頂空生成時(shí)間(5、10、15 min) 對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。方差結(jié)果表明樣品頂空生成時(shí)間對(duì)傳感器S5、S7 影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),對(duì)其余8個(gè)傳感器響應(yīng)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (表4)。典則判別分析表明成分1 占68.80%,成分2占31.20%,反映出全部的原始信息,見(jiàn)圖1。與樣品量規(guī)律相同,沿成分1 增大的方向,頂空生成時(shí)間逐漸增大,頂空生成時(shí)間15 min 的數(shù)據(jù)點(diǎn)較5、10 min 的數(shù)據(jù)點(diǎn)更為聚集。

2.1.3 頂空體積 在三七樣品量1.5 g、頂空生成時(shí)間15 min、載氣體積流量300 mL/min、清洗時(shí)間80 s、采樣時(shí)間90 s 條件下,研究樣品頂空體積(150、250、500 mL) 對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。方差結(jié)果表明樣品頂空體積對(duì)傳感器S4、S5 影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),對(duì)S7 響應(yīng)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),對(duì)其余7 個(gè)傳感器響應(yīng)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (表4)。典則判別分析表明成分1 占63.74%,成分2 占36.26%,反映出全部的原始信息,見(jiàn)圖1。頂空體積250 mL的數(shù)據(jù)點(diǎn)較150 mL 時(shí)更為聚集,且數(shù)據(jù)區(qū)分性較500 mL 時(shí)更佳。

圖1 單因素典則判別分析結(jié)果Fig.1 Results of single factor canonical discriminant analysis

2.1.4 載氣體積流量 在三七樣品量1.5 g、樣品頂空體積250 mL、頂空生成時(shí)間15 min、清洗時(shí)間80 s、采樣時(shí)間90 s 條件下,研究載氣體積流量(200、300、400 mL/min) 對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)信號(hào)的影響。方差結(jié)果表明載氣體積流量對(duì)傳感器S5 影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),對(duì)其余9 個(gè)傳感器響應(yīng)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (表4)。典則判別分析表明成分1 占84.95%,主成分占15.05%,反映出全部的原始信息,見(jiàn)圖1。載氣體積流量為 400 mL/min 的數(shù)據(jù)點(diǎn)較 200、300 mL/min的數(shù)據(jù)點(diǎn)更為聚集。

按表3 各因素和水平設(shè)計(jì)量,采用單因素方差分析樣品量、頂空生成時(shí)間、頂空體積和載氣體積流量對(duì)電子鼻10 個(gè)傳感器第89 s 的響應(yīng)信號(hào)值,采用典則判別對(duì)4 個(gè)因素不同水平樣品進(jìn)行分析,以數(shù)據(jù)點(diǎn)的聚集性和對(duì)樣品的區(qū)分效果來(lái)分別確定各較佳檢測(cè)條件為樣品1.5 g、頂空生成時(shí)間15 min、頂空體積250 mL、載氣體積流量400 mL/min、清洗時(shí)間80 s、采樣時(shí)間89 s。

2.2 三七傳感器特征響應(yīng)曲線(xiàn) 在較佳檢測(cè)條件下,對(duì)表1 中3 個(gè)不同產(chǎn)地三七主根進(jìn)行檢測(cè),繪制傳感器特征響應(yīng)曲線(xiàn),見(jiàn)圖2。前30 s 傳感器對(duì)三七樣品中的揮發(fā)物快速響應(yīng),之后逐漸平衡；但不同產(chǎn)地三七達(dá)到平衡的時(shí)間不一樣,QB、GJ 和ZY 達(dá)到平衡的響應(yīng)信號(hào)分別為65、60、55 s。不同產(chǎn)地三七對(duì)響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度也不同,QB 最強(qiáng)、ZY較弱,特別是傳感器S6、S7,其次是S2、S8、S9,這為利用電子鼻判定三七產(chǎn)地提供數(shù)據(jù)支持,為進(jìn)一步對(duì)比不同產(chǎn)地的差異,提取第89 s 響應(yīng)信號(hào)均值繪制雷達(dá)圖,見(jiàn)圖3。響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度大的QB在最外層,其次是GJ,ZY 在最里層,利用原始信號(hào)可初步實(shí)現(xiàn)對(duì)不同產(chǎn)地三七的區(qū)分,后續(xù)數(shù)據(jù)分析時(shí)均用提取的第89 s 數(shù)據(jù)。

2.3 基于氣味信息對(duì)三七品質(zhì)定性判別

圖2 不同產(chǎn)地三七主根電子鼻特征響應(yīng)信號(hào)Fig.2 E-nose characteristic response for taproots of P.notoginseng from different growing areas

圖3 不同產(chǎn)地三七主根電子鼻特征響應(yīng)信號(hào)雷達(dá)圖Fig.3 Radar map of E-nose characteristic response signals for taproots of P.notoginseng from different growing areas

2.3.1 三七主根與支根定性判別 為實(shí)現(xiàn)三七主根與支根定性判別,對(duì)電子鼻檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行主成分分析與典則判別分析,見(jiàn)圖4,前者結(jié)果表明成分1 占42.26%,成分2 占32.67%,共解釋原始數(shù)據(jù)74.93%的信息。不同產(chǎn)地三七主根樣品部分重疊,分布于圖下方,不同產(chǎn)地三七支根樣品也有重疊,分布于圖上方,成分2 大于0 的區(qū)域?yàn)槿咧Ц鶚悠?成分2 小于0 的區(qū)域?yàn)槿咧鞲鶚悠?故依據(jù)成分2 可區(qū)分主根與支根,見(jiàn)圖4。典則判別分析結(jié)果表明成分1 占93.77%,成分2 占3.77%,共解釋了原始變量97.54% 的信息。不同產(chǎn)地三七主根樣品部分重疊性較強(qiáng),分布于圖左側(cè),不同產(chǎn)地三七支根樣品分布于圖右側(cè),成分1 大于0 的區(qū)域?yàn)槿咧Ц鶚悠?成分1 小于0 的區(qū)域?yàn)槿咧鞲鶚悠?故依據(jù)成分1 也可將主根與支根區(qū)分開(kāi),見(jiàn)圖4。2 種分析方法中主根與支根區(qū)分明顯,相較于主成分分析結(jié)果,典則判別分析結(jié)果數(shù)據(jù)的聚集性更強(qiáng),更容易進(jìn)行區(qū)分。

2.3.2 三七產(chǎn)地定性判別 為區(qū)分不同三七產(chǎn)地,分別對(duì)3 個(gè)產(chǎn)地的三七主根、支根進(jìn)行典則判別分析,見(jiàn)圖5。不同產(chǎn)地主根典則判別分析結(jié)果表明成分1 占67.83%,成分2 占32.17%,反映出全部的原始信息。沿成分1 逐漸變大的方向,呈現(xiàn)ZY、GJ、QB 分布的趨勢(shì),3 個(gè)產(chǎn)地區(qū)分效果明顯。不同產(chǎn)地支根典則判別分析結(jié)果表明成分1 占81.80%,成分2 占18.20%,反映出全部的原始信息。3 個(gè)產(chǎn)地區(qū)雖能實(shí)現(xiàn)區(qū)分,但產(chǎn)地與產(chǎn)地之間距離較近,沒(méi)有主根區(qū)分效果好,因此電子鼻檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)三七產(chǎn)地溯源,三七主根、支根在產(chǎn)地判斷上均具有可行性。

圖4 三七主根與支根判別結(jié)果Fig.4 Discriminant results of taproot and rootlet of P.notoginseng

2.4 三七品質(zhì)定量判別分析 MLP 是一種前向結(jié)構(gòu)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),由多個(gè)節(jié)點(diǎn)層組成,每一層全連接到下一層,在每一層中有一些神經(jīng)元與加權(quán)連接有關(guān),這些神經(jīng)元的數(shù)量取決于模型的輸入和輸出變量的數(shù)量［22］。為實(shí)現(xiàn)三七主根與支根及產(chǎn)地的定量判別,對(duì)電子鼻響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行MLP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。

圖5 不同產(chǎn)地三七典則判別分析結(jié)果Fig.5 Canonical discriminant analysis results for P.notoginseng from different growing areas

在主根和支根判別時(shí),以電子鼻10 個(gè)傳感器響應(yīng)作為輸入層,主根和支根兩類(lèi)為輸出層,采用10-6-2 網(wǎng)格結(jié)構(gòu),即輸入層10 個(gè)神經(jīng)元、隱藏層6個(gè)神經(jīng)元和輸出層2 個(gè)神經(jīng)元；判斷結(jié)果表明應(yīng)用MLP 可很好區(qū)分三七主根與支根,只有1 個(gè)支根樣品被錯(cuò)分為主根樣品,樣品分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)99.49%,見(jiàn)表5。10-6-2 網(wǎng)格混淆矩陣［23］的4 個(gè)基本指標(biāo)準(zhǔn)確率、精確率、靈敏度、特異度、以及AUS 的平均值分別為99.49%、99.49%、99.50%、99.50%、99.50%,見(jiàn)表6。

在三七產(chǎn)地判別時(shí),分別以主根、支根傳感器響應(yīng)作為輸入層,采用10-6-3 網(wǎng)格作為最終結(jié)構(gòu),即輸入層10 個(gè)神經(jīng)元、隱藏層6 個(gè)神經(jīng)元和輸出層3 個(gè)神經(jīng)元,判斷結(jié)果表明應(yīng)用MLP 可區(qū)分三七產(chǎn)地,見(jiàn)表7。所建主根產(chǎn)地判別中,1 個(gè)QB主根樣品錯(cuò)分為GJ 主根樣品,樣品分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)99.49%；所建支根產(chǎn)地判別中,2 個(gè)QB 支根被錯(cuò)判為GJ 支根,2 個(gè)GJ 支根樣品錯(cuò)分為ZY 支根,樣品分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)95.95%。10-6-3 網(wǎng)格混淆矩陣表明主根產(chǎn)地判別準(zhǔn)確率、精確率、靈敏度、特異度以及AUS 的平均值分別為99.32%、98.98%、99.01%、99.50%、99.25%,見(jiàn)表8；支根產(chǎn)地判別準(zhǔn)確率、精確率、靈敏度、特異度以及AUS 的平均值分別為 97.29%、95.95%、96.07%、98.00%、97.03%；綜上所述,MLP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析對(duì)三七主根與支根及產(chǎn)地的判定準(zhǔn)確率均在95.00%以上。結(jié)合MLP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),電子鼻信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)三七主根與支根及產(chǎn)地的定量區(qū)分。

表5 主根和支根混淆矩陣鑒別結(jié)果Tab.5 Results of confusion matrix for identification of taproot and rootlet

表6 MLP 分類(lèi)10-6-2 網(wǎng)格性能參數(shù)（%）Tab.6 Performance parameters of 10-6-2 grid MLP classifier （%）

表7 產(chǎn)地判別混淆矩陣結(jié)果Tab.7 Results of confusion matrix for discrimination of growing areas

3 結(jié)論

結(jié)合模式識(shí)別方法,電子鼻技術(shù)在中草藥產(chǎn)地、品種、來(lái)源及加工方式判別研究中有較多應(yīng)用。Wang 等［24］采用深卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分析了石斛電子鼻氣味信息對(duì)石斛產(chǎn)地進(jìn)行分類(lèi),且其準(zhǔn)確率為87.56%。結(jié)合主成分分析和判別因子分析,劉曉梅等［25］運(yùn)用電子鼻可以區(qū)分地龍及其炮制品。在姜黃屬4 種中藥的鑒別中,利用氣味指紋圖譜建立的XG-Boost 判別模型可以快速判別其種屬,訓(xùn)練集、測(cè)試集正判率分別達(dá)99.39%、95.65%［26］。對(duì)不同來(lái)源的南北五味子,利用其氣味指紋圖譜進(jìn)行判別因子分析,正確識(shí)別率可達(dá)100%［27］。此外,電子鼻氣味信息結(jié)合色度信息在厚樸產(chǎn)地判別中也顯示了其優(yōu)勢(shì),分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)99.53%［28］。

表8 MLP 分類(lèi)10-6-3 網(wǎng)格性能參數(shù)（%）Tab.8 Performance parameters of 10-6-3 grid MLP classifier （%）

三七中揮發(fā)性呈香物質(zhì)主要為萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、烯烴類(lèi)和烷烴類(lèi)等,尤其是萜烯類(lèi)發(fā)揮了重要作用［29］。而三七的質(zhì)量、產(chǎn)地和采摘季節(jié)等均對(duì)其內(nèi)部成分有影響,外部表現(xiàn)為其氣味的細(xì)微差異,利用氣味信息評(píng)價(jià)三七綜合品質(zhì)具有可行性。本研究應(yīng)用單因素方差分析結(jié)合典則判別分析建立了電子鼻檢測(cè)三七的最佳條件為樣品量1.5 g、頂空生成時(shí)間15 min、頂空體積250 mL、載氣體積流量400 mL/min。結(jié)合主成分分析與典則判別分析可實(shí)現(xiàn)電子鼻對(duì)三七主根與支根的定性區(qū)分,典則判別分析能實(shí)現(xiàn)三七產(chǎn)地的定性區(qū)分,其中主根產(chǎn)地區(qū)分效果比支根產(chǎn)地區(qū)分效果好。MLP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析能實(shí)現(xiàn)對(duì)三七主根、支根的定量區(qū)分,準(zhǔn)確率高達(dá)99.49%；在主根產(chǎn)地判別時(shí),準(zhǔn)確率為99.49%；在支根產(chǎn)地判別時(shí),準(zhǔn)確率為95.95%。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的電子鼻檢測(cè)條件較理想,可實(shí)現(xiàn)對(duì)三七主根、支根及產(chǎn)地的定性、定量判別。在今后的研究中,可嘗試將電子鼻氣味信息應(yīng)用到三七內(nèi)部活性成分含量的檢測(cè)中,實(shí)現(xiàn)其內(nèi)部品質(zhì)的快速、無(wú)損評(píng)價(jià),以期為市場(chǎng)監(jiān)控三七品質(zhì)和產(chǎn)地判別提供新的檢測(cè)方法。