胡 楊，丁曉倩，嚴(yán) 輝*，吳垠志，彭國平，黃勝良

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210023；2.江蘇融昱藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223001）

中藥材的質(zhì)量是整個(gè)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)鏈的基石,中共中央、國務(wù)院發(fā)布《關(guān)于促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》,提出“大力推動(dòng)中藥質(zhì)量提升和產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展”,要求“加強(qiáng)中藥材質(zhì)量控制,促進(jìn)中藥飲片和中成藥質(zhì)量提升,促進(jìn)中藥飲片優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)”［1］。然而目前市場用于規(guī)范中藥材質(zhì)量的法定標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》 實(shí)行的是最低準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn),除少數(shù)品種外大多未規(guī)定其農(nóng)藥殘留、重金屬等指標(biāo)［2］,也未對藥材商品規(guī)格等級做進(jìn)一步區(qū)分。

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.(L.chuanxiong) 的干燥根莖,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效,是臨床常用的大宗中藥材［3-4］。傳統(tǒng)川芎的商品等級劃分主要依據(jù)其個(gè)頭大小,但劃分的科學(xué)內(nèi)涵尚不明確,現(xiàn)行川芎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下僅對阿魏酸進(jìn)行限定,檢測指標(biāo)單薄,無法全面的評價(jià)藥材飲片的質(zhì)量優(yōu)劣［5］。同時(shí),被譽(yù)為“產(chǎn)后第一方” 的新生化顆粒,由當(dāng)歸、川芎、益母草、桃仁和紅花等7 味藥組成,在婦科用藥領(lǐng)域需求量大。現(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WB3-B-1056-91-2015),該標(biāo)準(zhǔn)只收載了理化鑒別項(xiàng)生物堿的沉淀反應(yīng)及當(dāng)歸、川芎中僅以阿魏酸為對照的薄層鑒別,不利于生產(chǎn)和使用的相關(guān)部門控制其藥品質(zhì)量［6］。而對源頭藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升可以更好的全面控制［7］。本研究在2020 年版《中國藥典》 川芎項(xiàng)下檢測項(xiàng)目基礎(chǔ)上,建立了川芎藥材多指標(biāo)成分檢測方法,增加川芎重金屬和有害元素殘留量,農(nóng)藥殘留量檢測限,同時(shí)使用一測多評法對川芎5 種指標(biāo)成分進(jìn)行測定,以期尋找川芎藥材等級與各質(zhì)控項(xiàng)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián),客觀有效表征川芎優(yōu)質(zhì)藥材標(biāo)準(zhǔn),為提升新生化顆粒等含川芎組方產(chǎn)品的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

BP211D 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司］；RT-1236 型馬弗爐(北京盈安美誠科學(xué)儀器有限公司)；NexION 350D 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Perkin Elmer 公司)；TSQ 8000 EVO 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀(美國賽默飛公司)；2695 型高效液相色譜儀、2998PDA 型紫外檢測器(美國Waters 公司)；Anke TGL-16B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HG-9023A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KH-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；XFB-200 型高速中藥粉碎機(jī)(吉首市中誠制藥機(jī)械廠)。

阿魏酸對照品(批號110773-201614,純度≥99%,中國食品藥品檢定研究院)；藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞對照品 (批號分別為 CHB160428、CHB160404,純度≥98%,南京金益柏生物科技有限公司)；阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A (批號分別為lw80315016、lw18050223,純度≥98%,南京良緯生物科技有限公司)；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、綠原酸、洋川芎內(nèi)酯H (純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)；冰醋酸等試劑為分析純；超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)制備)。

從江蘇融昱藥業(yè)有限公司、四川什邡市隱峰鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社等共收集28 批川芎藥材,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)輝副教授鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別及等級形態(tài)學(xué)參數(shù)測定 依據(jù)2020年版《中國藥典》 及《中藥材商品規(guī)格等級 川芎》 (TCACM 1021.51—2018) 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)對川芎藥材的大小、形狀、色澤及質(zhì)地等性狀進(jìn)行描述,利用數(shù)碼相機(jī)拍攝并記錄。采用四分法對每批樣品進(jìn)行取樣,隨機(jī)選取1 kg 川芎藥材,測定每份樣品個(gè)數(shù)和質(zhì)量,重復(fù)3 次取平均值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),川芎一等品每40 個(gè)以內(nèi)/kg,單個(gè)質(zhì)量不低于20 g；二等品70 個(gè)以內(nèi)/kg,單個(gè)質(zhì)量不低于12 g,三等品70 以外/kg,統(tǒng)貨不分大小。

2.2 雜質(zhì)、水分、灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物 按2020 年版《中國藥典》 (四部)［8］雜質(zhì)檢查法(通則2301),水分測定法(通則0832)第四法,灰分測定法(通則2302) 項(xiàng)下總灰分及酸不溶性灰分測定法,浸出物測定法(通則2201)項(xiàng)下的醇浸出物測定法(熱浸法) 分別對雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物進(jìn)行測定。

2.2.1 雜質(zhì)檢查 川芎藥材的雜質(zhì)檢查情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)一、二、三等品無雜質(zhì),統(tǒng)貨的雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%～3.0%。依據(jù)《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》 規(guī)定雜質(zhì)含量不超過10.0%的要求,各批藥材雜質(zhì)含量符合要求。

2.2.2 水分測定 檢測結(jié)果顯示,28 批川芎藥材樣品其水分含量多在6.98%～11.38%范圍內(nèi)浮動(dòng),平均值9.11%,均未超出《中國藥典》 中對中藥藥材含水量不超過12.0% 的限度要求,川芎一等品水分含量9.56%～10.64%,平均值10.15%；二等品水分含量7.57%～7.99%,平均值7.80%；三等品水分含量6.98%～8.73%,平均值8.09%；統(tǒng)貨水分含量8.66%～11.38%,平均值10.41%,見圖1。

圖1 川芎藥材中水分、灰分和醇溶性浸出物含量的頻率分布直方圖Fig.1 Frequency distribution histogram for intrinsic indexes of L.chuanxiong

2.2.3 總灰分和酸不溶性灰分檢測 28 批川芎藥材樣品總灰分在4.03%～7.93%范圍內(nèi),酸不溶性灰分在0.75%～3.09%范圍內(nèi),不同批飲片灰分測定結(jié)果波動(dòng)大,且總灰分高的酸不溶性灰分也高。部分樣品超出《中國藥典》 中對中藥藥材總灰分和酸不溶性灰分的限度要求 (6 批總灰分大于6.0%,4 批酸不溶性灰分大于2.0%),推測可能與藥材樣品泥沙雜質(zhì)過多有關(guān),建議市售與產(chǎn)區(qū)藥材需要進(jìn)行雜質(zhì)清理以便深入進(jìn)行灰分過高原因探究。

2.2.4 醇溶性浸出物測定 經(jīng)檢驗(yàn),28 批樣品中,醇溶性浸出物含量在16.85%～35.01%范圍內(nèi)浮動(dòng),平均值28.38%,皆大于藥典限定要求的12.0%,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道什邡地區(qū)川芎浸出物平均值30.91%,分析種質(zhì)資源對川芎質(zhì)量影響明顯,同時(shí)產(chǎn)地及栽培技術(shù)也可能是影響其醇浸出物含量的重要因素［9］,綜合各批結(jié)果,參考香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)中對川芎浸出物檢測限的規(guī)定［10］,建議可提高川芎藥材醇溶性浸出物限度不得小于20.0%,優(yōu)質(zhì)藥材限度不得小于25.0%。

2.3 重金屬和有害元素測定 委托南京卡文思檢測技術(shù)有限公司,利用NexION 350D 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,按《中國藥典》 收載的鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321) 對收集的川芎藥材進(jìn)行重金屬及有害元素測定,結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示,5 種重金屬的殘留量均未超過《中國藥典》所規(guī)定的限度,其中鉛、砷2 種元素在川芎藥材中均未檢測出,鎘元素含量在0.44～0.67 mg/kg 范圍內(nèi)浮動(dòng),平均值0.52 mg/kg,與郭蘭萍等［11］統(tǒng)計(jì)常用中藥材重金屬超標(biāo)情況,川芎中鎘含量平均值為(0.54±0.49) mg/kg 一致。

2.4 農(nóng)藥殘留量測定 在川芎生產(chǎn)過程中,由于遭受根腐病、白粉病、蠐螬、莖節(jié)蛾等多種病蟲害,產(chǎn)地藥農(nóng)多施用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。據(jù)調(diào)查,目前使用的農(nóng)藥主要有甲基硫菌靈、毒死蜱和擬除蟲菊酯類等［12］。本實(shí)驗(yàn)委托南京卡文思檢測技術(shù)有限公司,利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀,按照藥典收載的農(nóng)藥殘留量測定法(通則2341) 對收集的川芎藥材進(jìn)行農(nóng)藥殘留測定,結(jié)果見表2,表明9 種農(nóng)藥殘留量均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的最高限度(GB 2763—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品中農(nóng)藥最大殘留限度》),除了統(tǒng)貨CX Ⅳ-7 批的二甲戊靈殘留量(0.297 mg/kg) 超過最高限度(0.2 mg/kg),同時(shí)發(fā)現(xiàn)統(tǒng)貨批農(nóng)藥殘留相比什邡產(chǎn)區(qū)仍較高,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道低劑量使用農(nóng)藥有利于“高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)” 川芎藥材的生產(chǎn),綜合各批結(jié)果,建議該9 種農(nóng)藥殘留量測定限為含敵敵畏不得過0.01 mg/kg；二苯胺不得過0.2 mg/kg；毒死蜱不得過0.1 mg/kg；二甲戊靈不得過0.01 mg/kg；pp-DDT不得過0.01 mg/kg；聯(lián)苯菊酯不得過0.02 mg/kg；甲氰菊酯、氯菊酯和溴氰菊酯不得檢出。

表2 樣品中重金屬及農(nóng)藥殘留含量測定結(jié)果（mg/kg， n=3）Tab.2 Results of content determination of heavy metals and pesticide residue in samples （mg/kg， n=3）

2.5 樣品含量測定 川芎中主要含有機(jī)酚酸、苯酞、生物堿類成分,但現(xiàn)行《中國藥典》 中川芎含量測定項(xiàng)下僅對阿魏酸進(jìn)行限定,較為單薄的指標(biāo),無法全面的評價(jià)藥材質(zhì)量優(yōu)劣,同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道［13］川芎藥材中生物堿成分川芎嗪含量不足萬分之一,故應(yīng)測定有機(jī)酸和苯酞類等主要功效成分的含量以便客觀評價(jià)和控制川芎的內(nèi)在質(zhì)量。但苯酞類化合物穩(wěn)定性差,作為含量測定用對照品穩(wěn)定性欠佳且成本較高,故本研究參考文獻(xiàn)［14-16］,選定阿魏酸作為內(nèi)標(biāo),建立洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A 和藁本內(nèi)酯的相對校正因子,利用相對校正因子計(jì)算5 種成分的含量,實(shí)現(xiàn)一測多評。

2.5.1 色譜條件 Waters Symmetry? C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.5%醋酸溶液(B),梯度洗脫(0～25 min,5%～45%A；25～35 min,45%～55% A；35～45 min,55%A；45～55 min,55%～95%A；55～60 min,95%A)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL,理論塔板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于6 000。色譜圖見圖2。

2.5.2 對照品溶液制備 稱取適量阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對照品,精密稱定,加甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為36.22、45.53、37.96、112.58、218.18 μg/mL的混合對照品溶液。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取川芎粉末(過4 號篩) 0.5 g,置于錐形瓶中,加入70% 甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,加熱回流30 min,放冷,再次稱定質(zhì)量,用70% 甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,靜置,取上清液,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.5.4 相對校正因子測定 以阿魏酸為內(nèi)標(biāo),計(jì)算不同進(jìn)樣量時(shí)洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A 和藁本內(nèi)酯對阿魏酸的校正因子f1～f4,RSD 均小于1.5%,結(jié)果見表3。

2.5.5 方法學(xué)考察

2.5.5.1 線性關(guān)系考察 分別將混合對照品溶液稀釋2、4、8、16、20 倍,在“2.5.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,以各對照品的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行回歸,結(jié)果見表4,表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分對阿魏酸的相對校正因子（n=3）Tab.3 Relative correction factors of various constituents with reference to ferulic acid （n=3）

表4 各成分線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.5.2 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液,在“2.5.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣6 次,每次進(jìn)樣10 μL,記錄各成分峰面積。結(jié)果顯示,阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯RSD分別為1.19%、1.24%、2.13%、1.49%、2.13%,表明儀器精密度良好。

2.5.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,在“2.5.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,分別記錄0、4、8、12、2 4 h 的色譜圖。結(jié)果顯示,各阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯RSD 分別為 0.82%、1.16%、0.77%、1.58%、1.84%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一川芎樣品6份,按“2.5.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.5.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL,記錄各待測成分峰面積,計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示,阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯RSD 分別為1.61%、1.92%、1.88%、1.02%、1.47%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的樣品粉末9 份,每3 份為一組,分別加入樣品中各成分含量的80%、100%、120%3 個(gè)水平的對照品溶液,進(jìn)行供試品溶液制備,在“2.5.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示,阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯平均回收率 為 97.47%、98.91%、102.36%、99.13%、99.36%,RSD 分別為1.91%、1.79%、1.82%、1.97%、1.82%。

2.5.6 樣品含量測定 在“2.5.1” 項(xiàng)條件下,對28 批樣品進(jìn)行含量測定,同時(shí)為了驗(yàn)證一測多評法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,本研究采用常規(guī)對照品作為外標(biāo)法的方法和一測多評法分別測定,結(jié)果顯示2 種方法所測得的含量無明顯差異,見表5,表明樣品中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A 和藁本內(nèi)酯的含量分別為0.071%～0.197%、0.017%～0.070%、0.015%～0.039%、0.186%～0.517%、0.986%～2.157%,平均值依次為0.132%、0.034%、0.024%、0.310%、1.554%。

表5 一測多評法和外標(biāo)法所得結(jié)果比較（%）Tab.5 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method （%）

2.6 質(zhì)控指標(biāo)差異性分析 利用GraphPad Prism 8軟件對不同等級川芎藥材的各質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行差異性分析,分別計(jì)算各指標(biāo)在不同等級之間的分布情況并進(jìn)行單因素方差分析。見圖3,針對水分,一等品與二等品、三等品之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.01),二等品、三等品與統(tǒng)貨之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；在阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A 和藁本內(nèi)酯含量上,一等品與二等品、三等品及統(tǒng)貨間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),二等品與三等品間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；一等品的阿魏酸松柏酯含量與三等品有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)。

2.7 質(zhì)控指標(biāo)的主成分分析 參考文獻(xiàn)［17］,采用SIMCA-P 14.1 軟件對在不同等級川芎藥材中具有一定差異性的內(nèi)在指標(biāo)進(jìn)行主成分分析處理,結(jié)果顯示主成分分析模型的R2X=0.77,Q2=0.51,表明該模型穩(wěn)定,預(yù)測能力較強(qiáng),見圖4。從中可以發(fā)現(xiàn),4 個(gè)等級的川芎藥材具有一定的區(qū)分度,其中一等品與其他3 個(gè)等級藥材沿著PC1軸能明顯分開,最易辨別,CX Ⅱ-1＼ -2 和CX Ⅳ-5 也歸屬到PC1 軸右側(cè),結(jié)合數(shù)據(jù)表明此區(qū)域?yàn)閮?yōu)質(zhì)藥材；二等品、三等品和統(tǒng)貨沿著PC2 軸能明顯分開,各組內(nèi)差異較小,且不同等級可以較好聚集,表明綜合上述5 種指標(biāo)有利于對不同等級川芎藥材的辨別。

圖3 川芎藥材質(zhì)控指標(biāo)的差異性分析Fig.3 Analysis on the index level difference for the quality control of Chuanxiong Rhizoma samples

圖4 28 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for twenty-eight batches of samples

3 討論

中藥材作為中成藥的源頭,其質(zhì)量是否均一、穩(wěn)定直接影響著最終中成藥產(chǎn)品的質(zhì)量好壞,進(jìn)而影響著臨床的有效性與安全性。目前大多數(shù)中藥材及中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究仍處于對單一或少數(shù)指標(biāo)成分作定性、定量質(zhì)控研究,且中藥具有多組分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn),此質(zhì)控研究模式無法全面準(zhǔn)確反映其質(zhì)量［18］,因此必須對其源頭及最終產(chǎn)品兩方面作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升,才能更有力的保證最終產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定。

本研究結(jié)合目前市場上已有的川芎藥材分級標(biāo)準(zhǔn)［19-20］,同時(shí)參考各國法典以及國際標(biāo)準(zhǔn),在對川芎藥材產(chǎn)地和市場調(diào)研的基礎(chǔ)上,綜合多種檢測方法對現(xiàn)有4 個(gè)等級川芎藥材進(jìn)行檢測和比較。在對不同等級川芎藥材的各質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析時(shí)發(fā)現(xiàn),水分、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A 和藁本內(nèi)酯含量不同等級之間均有一定差異性。進(jìn)一步通過主成分分析處理后發(fā)現(xiàn),4 個(gè)等級的川芎藥材具有較明顯的區(qū)分,表明川芎藥材商品等級的外觀性狀,如每千克藥材所含個(gè)數(shù)等,與內(nèi)在質(zhì)量之間存在一定的相關(guān)性。因此,建議主要依據(jù)川芎藥材的個(gè)數(shù),質(zhì)量等外觀形狀,并結(jié)合水分、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A 和藁本內(nèi)酯含量等內(nèi)在指標(biāo)對該藥材進(jìn)行等級劃分。