劉 錕，王健英，魏 莉，潘穎宜，袁 穎*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201203）

杜仲Eucommiaul moidesOliv.為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木,是我國(guó)特有的常用中藥材。其干燥樹皮藥用,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等作用［1］,《神農(nóng)本草經(jīng)》 將其列為上品,在我國(guó)已有兩千多年藥用歷史,但因杜仲樹皮達(dá)到藥用的生長(zhǎng)周期長(zhǎng),且不可再生等,導(dǎo)致杜仲藥用資源緊缺［2］?，F(xiàn)代研究［3-4］表明杜仲富含木脂素、苯丙素、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜等成分,具有降血脂、降血壓［5］、降血糖［6］、抗骨質(zhì)疏松［7］、抗腫瘤［8］、抗菌［9］、抗炎［10-11］等藥理作用,且杜仲不同藥用部位的各成分含量有所差異［12-14］。但課題組尚未見國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲皮、葉和雄花3 個(gè)藥用部位的成分進(jìn)行比較的研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)擬比較杜仲皮、葉、雄花中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素和白樺脂酸8 種成分含量的差異,以期為杜仲的質(zhì)量控制,藥用資源的拓展以及藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)的闡述提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 系統(tǒng),配置四元泵、DAD檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜工作站、gilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)Agilent 公司)；MIKRO 220R低溫離心機(jī)(德國(guó)MIKRO 公司)；BSA124S 分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；SQP 分析天平(十萬分之一,賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；SK7200HP 超聲波清洗儀(上海科尋超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 杜仲皮、杜仲葉、杜仲雄花信息見表1,經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室吳靳榮副教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommiaul moidesOliv.的干燥樹皮、葉、雄花。桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸對(duì)照品(批號(hào)分別 為 B21238、B20635、B21661、B20636、B21213、B20782、B20527、B20041,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、甲酸(批號(hào)分別為20170812、A117-50,色譜級(jí),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(批號(hào)B9012-03,色譜級(jí),北美J.T.Baker 公司)；水為娃哈哈純凈水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 用于檢測(cè)7 種成分供試品溶液 取干燥杜仲皮、葉打粉,過40 目篩,精密稱取樣品各1.00 g,加入50%甲醇溶液25 mL 并充分混勻,靜置30 min 后再超聲提取30 min,于4 ℃6 000 r/min條件離心3 min 后取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液即得(4 ℃條件下存放)。精密稱取干燥杜仲雄花(未打粉) 1.00 g,同法制備得供試品溶液。

2.1.2 用于檢測(cè)白樺脂酸供試品溶液 取干燥杜仲皮、葉打粉,過40 目篩,精確稱取各樣品1.00 g,加入75% 甲醇25 mL 并充分混勻稱定質(zhì)量,然后回流提取1 h 并補(bǔ)足減失質(zhì)量,于4 ℃6 000 r/min 條件離心3 min 后取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,再取續(xù)濾液即得(4 ℃條件下存放)。稱取干燥杜仲雄花(未打粉) 1.00 g,同法制備得供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液 精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素和白樺脂酸對(duì)照品適量,用甲醇制備成含8 種成分的混合對(duì)照品溶液,其母液質(zhì)量濃度分別 為1.558、1.605、0.320、0.282、0.422、1.742、0.445、2.250 mg/mL,溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液即得。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～40 min,5%～15% A；40～50 min,15%～25% A；50～60 min,25%～30%A；60～65 min,30%～5%A；65～80 min,5%～5% A)；白樺脂酸為等度洗脫(0～30 min,82%A)；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣器溫度4 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)194、202、238、320、368、210 nm。8 種混合對(duì)照品及杜仲皮、葉、雄花樣品HPLC 色譜圖,見圖1～6。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.3” 項(xiàng)下8 種混合對(duì)照品貯備液,用甲醇適當(dāng)稀釋成不同的質(zhì)量濃度,在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表2,表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 桃葉珊瑚苷HPLC 色譜圖（λ=194 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of aucubin （λ=194 nm）

圖2 松脂醇二葡萄糖苷色譜圖（λ=202 nm）Fig.2 HPLC chromatograms of pinoresinol diglucoside （λ=202 nm）

圖3 各成分HPLC 色譜圖（λ=238 nm）Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents （λ=238 nm）

圖4 綠原酸HPLC 色譜圖（λ=320 nm）Fig.4 HPLC chromatograms of chlorogenic acid （λ=320 nm）

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3” 項(xiàng)下8 種混合對(duì)照品貯備液,在“2.2” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,第2 天再連續(xù)進(jìn)樣6 次,分別記錄峰面積,計(jì)算得桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸的日內(nèi)峰面積RSD 分別為2.07%、1.88%、0.70%、0.54%、1.67%、0.66%、0.98%、0.14%；日間峰面積RSD 分別為2.53%、1.31%、0.42%、0.44%、1.83%、0.49%、0.36%、1.59%,表明儀器日內(nèi)、日間精密度均良好。

圖5 槲皮素HPLC 色譜圖（λ=368 nm）Fig.5 HPLC chromatograms of querctin （λ=368 nm）

圖6 白樺脂酸HPLC 色譜圖（λ=210 nm）Fig.6 HPLC chromatograms of betulinic acid （λ=210 nm）

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.1” “2.1.2” 項(xiàng)下供試品溶液,在“2.2” 項(xiàng)條件下,分別于0、4、8、12、24、36 h 進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算得桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸RSD 分別 為 3.0%、0.38%、1.73%、2.74%、1.04%、1.11%、1.60%、2.89%,表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品,分別按“2.1.1” “2.1.2” 項(xiàng)下方法制備7 種成分和白樺脂酸的供試品溶液6 份,在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算得桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸含量RSD 分別為2.69%、1.18%、2.14%、1.39%、2.27%、0.90%、1.16%、2.38%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批含量已知的樣品,精密加入桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸(質(zhì)量濃度分別為1.122、1.933、0.274、0.449、2.623、0.504、0.414、1.134 mg/mL)的對(duì)照品溶液各0.27、0.3、0.31、0.34、0.33、0.36、0.28、0.25 mL；0.54、0.6、0.62、0.68、0.66、0.72、0.56、0.50 mL；0.81、0.9、0.93、1.02、0.99、1.08、0.84、0.75 mL,并使得加入樣品的溶劑總體積為25 mL,分別按 “2.1.1”“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備7 種成分和白樺脂酸的供試品溶液9 份,在“2.2” 項(xiàng)條件下測(cè)定,記錄峰面積,分別計(jì)算8 種成分50%、100%、150%水平的平均加樣回收率。結(jié)果,桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素和白樺脂酸平均加樣回收率分別為100.90%、103.58%、100.75%、97.70%、104.33%、95.75%、95.02%、101.79%,RSD 分別為1.49%、0.35%、1.00%、1.37%、0.63%、0.28%、0.99%、1.96%。

2.4 樣品含量測(cè)定 精密稱定杜仲皮、葉、雄花各1.00 g,分別按“2.1.1” “2.1.2” 項(xiàng)下方法制備7 種成分和白樺脂酸的供試品溶液各6 份,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,記錄峰面積。表3、圖7 表明,杜仲皮、葉、雄花中8 種成分的含量存在差異,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、白樺脂酸的含量由高到低次序?yàn)樾刍ǎ救~＞皮,綠原酸含量高低次序?yàn)槿~＞雄花＞皮,而京尼平在杜仲皮中含量最高,且松脂醇二葡萄糖苷只在皮中檢出。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=3，mg/g） ）

圖7 杜仲皮、葉、雄花中8 種成分含量Fig.7 Contents of eight chemical constituents in the bark，leaves and male flowers of E.ulmoides

3 討論

杜仲所含化學(xué)成分種類繁多,以單一成分評(píng)價(jià)杜仲的成分差異或作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有所欠缺。故本實(shí)驗(yàn)選擇8 種指標(biāo)成分,分別代表杜仲中黃酮、環(huán)烯醚萜、木脂素、苯丙素、三萜類5 種主要有效成分［7-8］。當(dāng)所檢成分極性差距大的情況下,采用同一方法對(duì)成分進(jìn)行提取和檢測(cè),可能會(huì)導(dǎo)致較大的結(jié)果誤差。本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)8 種成分中,考慮到白樺脂酸極性與其他7 種成分相差較大,故參照2020 年版《中國(guó)藥典》 及文獻(xiàn)［15］,采取單因素考察,并進(jìn)行多波長(zhǎng)檢測(cè)后采集光譜數(shù)據(jù)分析,后決定將白樺脂酸提取及洗脫方式區(qū)別于其他7 種成分,所得結(jié)果良好。

杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷和京尼平含量最高,而杜仲葉及雄花中未檢測(cè)到松脂醇二葡萄糖苷,這主要因?yàn)槟局仡惓煞种饕嬖谟谥参锏哪静亢蜆渲?故《中國(guó)藥典》 將松脂醇二葡萄糖苷作為杜仲皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。杜仲雄花中環(huán)烯醚萜類成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷含量以及三萜類白樺脂酸含量均明顯高于皮和葉,表明萜類可能是杜仲雄花的主要成分,可將雄花中的桃葉珊瑚苷和白樺脂酸作為評(píng)價(jià)其藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分。杜仲葉中苯丙素類成分綠原酸含量最高。雖然有研究認(rèn)為杜仲黃酮是杜仲的主要有效成分,但本次檢測(cè)中槲皮素在3 個(gè)藥用部位含量都很少,提示如果要對(duì)杜仲黃酮作進(jìn)一步研究,還應(yīng)選擇杜仲中其他黃酮類成分進(jìn)行分析。

同一部位不同批檢測(cè)結(jié)果顯示,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、白樺脂酸含量呈現(xiàn)出較大的離散度,其他成分則相對(duì)穩(wěn)定。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、白樺脂酸主要存在于杜仲雄花和葉中,除了藥用部位本身造成的主要差異外,產(chǎn)地、采收時(shí)間等因素也會(huì)對(duì)成分含量造成影響,這與文獻(xiàn)［16-18］ 報(bào)道一致。

4 結(jié)論

本研究建立的方法高效靈敏、操作簡(jiǎn)單,能夠準(zhǔn)確描述杜仲3 個(gè)藥用部位中8 種成分的含量特征。杜仲皮松脂醇二葡萄糖苷、京尼平含量最高；杜仲葉綠原酸含量最高；杜仲雄花中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷、白樺脂酸含量最高,其中桃葉珊瑚苷和白樺脂酸或可作為杜仲雄花質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。以期本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為杜仲資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),且能更全面評(píng)價(jià)其藥材質(zhì)量,為后續(xù)杜仲藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。