范 興，蔡沓栗，楊成梓，黃德福*

(1.福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院藥學部，福建 福州 350025；2.中國人民解放軍聯(lián)勤部隊第九〇〇醫(yī)院藥學科，福建 福州 350025；3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

肝寶膠囊為福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院院內(nèi)制劑,適用于脂肪肝及急、慢性肝炎之肝熱積滯證,已使用二十年,臨床療效顯著［1-2］,但目前對非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD) 作用機制尚不明確。故本研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS 的代謝組學方法,對NAFLD 大鼠血清代謝物進行分析鑒定,篩選差異代謝物,分析其相關(guān)代謝通路,從內(nèi)源性代謝角度探討肝寶膠囊治療NAFLD 可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠,體質(zhì)量(180±20) g,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (滬) 2017-0005。

1.2 試劑與藥物 肝寶膠囊(每粒0.34 g,批號190203,閩藥制字Z04107020) 由福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院制劑室制備,取內(nèi)容物適量,蒸餾水依次稀釋至288、144、72 g/L；復(fù)方蛋氨酸膽堿片(每 片 0.45 g,批 號 20180402,國藥準字H22024764) 購于通化東寶藥業(yè)股份有限公司。高脂飼料(87.3%基礎(chǔ)飼料+2% 膽固醇+10% 豬油+0.7%豬膽鹽,批號20190501) 由上海帆泊生物科技有限公司定制。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 試劑盒(批號20190408)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 試劑盒 (批 號20190407)、總膽固醇(TC) 試劑盒(批號20190301)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號20190228)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 試劑盒(批號20190322)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 試劑盒(批號20190321) 均購于南京建成生物工程研究所。甲醇 (批號18095161)、乙腈 (批號197336)、甲酸 (批號1993715) 為色譜純,均購于美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 儀器 Acquity TM ultra 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公 司)；酶標儀 (美 國 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,將62 只大鼠隨機分為分成空白組10 只,給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),造模組52 只,給予高脂飼料,自由飲水,持續(xù)飼養(yǎng)8 周后,隨機處死造模大鼠2 只,取出肝臟做病理切片,判斷模型是否復(fù)制成功。造模成功后,按照隨機數(shù)字表法將造模成功SD 大鼠隨機分為5 組:模型組、復(fù)方蛋氨酸膽堿片陽性對照組(365 mg/kg)和肝寶膠囊 高、中、低劑量組 (1 440、720、360 mg/kg),未進行造模大鼠作為空白組,每組均10 只,劑量均按人與大鼠體表面積折算的等效劑量比值轉(zhuǎn)換計算［3］,灌胃給藥,1 次/d,空白組與模型組用等劑量的生理鹽水灌胃,連續(xù)4 周。給藥期間,空白組繼續(xù)喂飼普通飼料,其余各組喂飼高脂飼料,至實驗結(jié)束。

2.2 標本采集與處理 末次給藥12 h 后,大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血至無抗凝劑的采血管中,靜置2 h 后,3 000 r/min 離心10 min,收集上層血清,分裝,嚴格按試劑盒說明操作,檢測血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C,剩余血清置-80 ℃凍存,由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進行UPLC-Q-TOF/MS 數(shù)據(jù)測試及分析。大鼠取血后,解剖取肝臟,取肝左葉相同部位用10% 中性甲醛固定,采用常規(guī)石蠟包埋,制作組織切片,蘇木精-伊紅(HE) 染色,在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)。

2.3 代謝組學數(shù)據(jù)采集

2.3.1 血清樣本前處理 取置于-80 ℃的血清樣本,在冰上解凍,取樣本20 μL 加預(yù)冷的50%甲醇120μL,渦旋1 min,室溫放置10 min,提取液在-20 ℃過夜,13 000 r/min 離心20 min 后,上清液轉(zhuǎn)入96 孔板,進行分析。QC 樣本通過取上述各組血清樣本10 μL,混合,按樣本處理方法制備,每3 個樣本插入1 個QC 樣本以檢驗實驗過程的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.3.2 色譜條件 ACQUITY UPLC T3 柱(100 mm×

2.1 mm,1.8 μm,美國Waters 公司),柱溫35 ℃,流動相:A 為0.1%甲酸水,B 為含0.1%甲酸的乙腈,進樣量4 μL,流速0.4 mL/min。梯度洗脫條件:0～0.5 min,5%B；0.5～7 min,5%～100%B；7～8 min,100% B；8～8.1 min,100%～5% B；8.1～10 min,5%B。

2.3.3 質(zhì)譜條件 UPLC-Triple-TOF 5600+液質(zhì)聯(lián)用儀:正、負離子兩種模式,噴霧電壓5 000 V 和-4 500 V；氣簾氣(CUR)30 psi(1 psi=0.133 kPa),霧化氣(Gs1) 60 psi,輔助氣(Gs2) 60 psi；離子源溫度(TEM) 650 ℃；二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式IDA 模式；掃描范圍m/z 60～1 200 Da；采集時間150 ms/spectrum,采集速率100 counts/s,總循環(huán)時間0.56 s。

2.3.4 數(shù)據(jù)分析 通過ProteoWizard 軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML 格式,利用XCMS 對數(shù)據(jù)進行峰對齊、峰提取、歸一化等步驟操作后,導(dǎo)入到SIMCA 14.1 軟件中進行多元統(tǒng)計學分析,包括主成分分析(PCA)、最小二乘法判別分析(PLSDA)、正交最小二乘法判別分析(OPLS-DA),再經(jīng)Metlin、HMDB、KEGG、in-house 標準品、MetaboAnalyst 4.0 等數(shù)據(jù)庫進行差異代謝物的比對鑒定及代謝通路分析,以進行非靶標代謝組學研究。通過SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析,數(shù)據(jù)以() 表示。

3 結(jié)果

3.1 肝寶膠囊對NAFLD 大鼠的作用

3.1.1 生化指標 表1 顯示,與空白組比較,模型組ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平升高(P＜0.01),HDL-C 水平下降(P＜0.01)；與模型組比較,各藥物治療組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平升高 (P＜0.01),HDL-C 水平降低(P＜0.01)。肝寶膠囊治療后,各組肝功能與血脂得到不同程度的恢復(fù),并隨劑量增加更明顯；與陽性對照組比較,肝寶膠囊低劑量組各指標無明顯差異(P＞0.05),肝寶膠囊中劑量組ALT、LDL-C 水平低于陽性組,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),其余指標差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.01)；高劑量組ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平低于陽性組(P＜0.01),HDL-C 水平更高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠生化指標比較（， n=10）Tab.1 Comparison of biochemical indices in rats among various groups （， n=10）

表1 各組大鼠生化指標比較（， n=10）Tab.1 Comparison of biochemical indices in rats among various groups （， n=10）

注:與空白組比較,**P＜0.01；與模型組比較,＃＃P＜0.01；與陽性對照組比較,▲▲P＜0.01。

3.1.2 肝臟組織病理學變化 圖1 顯示,空白組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝細胞無脂肪變性,肝細胞大小均一,排列均勻,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細胞索整齊排列；模型組大鼠肝細胞體積增大、腫脹,可見肝細胞脂肪變性明顯,出現(xiàn)許多大小不等的空泡,細胞核擠向一側(cè),炎性細胞浸潤；給藥組均能不同程度改善肝臟組織脂肪病變,并隨著給藥劑量增加效果更明顯,其中肝寶膠囊高劑量組基本接近空白組形態(tài)；陽性對照組改善作用強于肝寶膠囊低劑量組,但弱于肝寶膠囊中劑量組。

3.2 肝寶膠囊代謝組學研究

3.2.1 血清代謝輪廓分析 空白組、模型組、肝寶膠囊高劑量組大鼠血清在正、負離子模式下的總離子流圖見圖2,可知各組輪廓大致相似,但代謝物含量有差異。

圖1 各組大鼠肝組織病理變化（HE，×400）Fig.1 Pathological changes of liver tissues of rats among various groups （HE，×400）

圖2 空白組（A，B）、模型組（C，D） 和肝寶膠囊組（E，F(xiàn)） 大鼠血清總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of rat serum for normal group （A，B），model group （C，D），and Ganbao Capsules group （E，F(xiàn)）

3.2.2 多元統(tǒng)計分析 對各組樣本數(shù)據(jù)進行PCA分析,發(fā)現(xiàn)QC 樣本聚集度高,說明實驗建立的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好,見圖3A、3B。在正、負離子模式下,R2X 均值大于0.4,表明模型可靠,各組間聚集趨勢良好。對各組樣本進一步采用PLS-DA 分析,發(fā)現(xiàn)各組之間明顯分離,其中空白組、模型組分別聚集在左右兩側(cè),代謝圖譜存在明顯的差異,表明模型復(fù)制成功。肝寶膠囊組與模型組明顯分開,并趨近于空白組,與生化指標、病理學改變結(jié)果一致,見圖3C、3D。對數(shù)據(jù)模型進行置換檢驗(n=200) 驗證,發(fā)現(xiàn)R2、Q2值均小于右端,前者在后者之上,并且后者回歸直線與縱軸截距為負值,表明模型有效可靠,未產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象,見圖3E、3F。

3.2.3 差異代謝物篩選 圖4A、4B 顯示,空白組與模型組可被顯著分開,表明模型具有較好解釋與預(yù)測能力 (正離子模式R2X=0.610,R2Y=0.998,Q2=0.974；負離子模式R2X=0.516,R2Y=0.999,Q2=0.981)。模型組與肝寶膠囊組比較,結(jié)果見圖4C、4D (正離子模式R2X=0.493,R2Y=0.991,Q2=0.994；負離子模式R2X=0.574,R2Y=0.993,Q2=0.959),可知OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠。對應(yīng)的S-plot 圖見圖4E～4H,結(jié)合VIP 值＞1、t檢驗P＜0.05,并以變異倍數(shù)FC＞2或＜0.5 為標準,確定潛在差異代謝物。同時,通過一、二級質(zhì)譜信息,并結(jié)合Metlin、HMDB、KEGG、in-house 標準品數(shù)據(jù)庫查詢和相關(guān)文獻報道進行結(jié)構(gòu)鑒定,最終篩選鑒定出26 個共有差異代謝物,見表2。

圖3 各組樣本的PCA （A，B）、PLS-DA （C，D） 得分圖和模型驗證（E，F(xiàn)）Fig.3 PCA （A，B），PLS-DA （C，D） score plots and permutation test （E，F(xiàn)） in various groups

3.2.4 差異代謝物的生物信息學分析 在HMDB數(shù)據(jù)庫中查詢26 個差異代謝物的細胞位置與生物學功能,發(fā)現(xiàn)主要存在于細胞外基質(zhì)、細胞膜、細胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；生物學功能主要作為膜穩(wěn)定劑、能源存儲、能量源、營養(yǎng)物及信號分子,提示肝寶膠囊在治療NAFLD 過程中可能的機理及作用方向,見圖5。

3.2.5 代謝通路分析 將篩選出的26 種差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0 軟件進行代謝通路分析,發(fā)現(xiàn)涉及相關(guān)代謝通路15 條,以P＜0.01、Impact＞0.10 為標準,篩選出3 條與肝寶膠囊治療NAFLD作用相關(guān)的最主要代謝途徑,即甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝,其中影響最顯著是鞘脂代謝,影響值最大的是花生四烯酸代謝,見圖6。

4 討論

本研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS 代謝組學方法探討肝寶膠囊對NAFLD 大鼠的干預(yù)作用機制,共尋找出26 個潛在差異代謝物,涉及3 條代謝通路,現(xiàn)主要從代謝途徑進行展開討論。

4.1 甘油磷脂代謝 篩選出的差異代謝物主要為磷脂類 (磷脂酰膽堿PC、溶血磷脂酰膽堿LysoPCs 與溶血磷脂酰乙醇胺LysoPEs),涉及了甘油磷脂代謝通路；與空白組比較,模型組中PC 含量均相對減少,大多數(shù)LysoPCs、LysoPEs 均出現(xiàn)上升,而經(jīng)給藥干預(yù)后回調(diào)接近正常水平；可能由于PC、PE 在磷脂酶A 作用下過量水解生成LysoPCs、LysoPEs［4］,以致PC 含量不足,合成的脂蛋白減少,不能有效地使肝內(nèi)脂肪運輸?shù)礁瓮?導(dǎo)致脂肪在肝臟中沉積,同時溶血磷脂酰膽堿是氧化型低密度脂蛋白的主要成分,可誘發(fā)炎癥反應(yīng)［5-6］,溶血卵磷脂類物質(zhì)含量過高,對細胞膜有毒性作用［7-8］,從而對細胞膜系統(tǒng)造成損傷,最終導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂,表明肝寶膠囊可能通過調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝通路,從而改善NAFLD。

圖4 各組OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score plots in various groups

圖5 差異代謝物分類Fig.5 Classification of differential metabolites

表2 各組大鼠血清差異代謝物Tab.2 Differential serum metabolites in rats in various groups

圖6 差異代謝物MetPA 通路分析Fig.6 MetPA analysis of differential metabolites

4.2 鞘脂代謝 鞘脂是一類以鞘氨醇為骨架的復(fù)雜化合物,在細胞代謝、生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、死亡等多種生物學功能中發(fā)揮重要作用。鞘氨醇、二氫鞘氨醇分別在神經(jīng)酰胺合成酶、脂肪酰轉(zhuǎn)移酶作用下形成神經(jīng)酰胺,神經(jīng)酰胺作為細胞凋亡信號調(diào)控的第二信使因子,參與了NAFLD 大鼠肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積過程［9-12］。在實驗中,模型組中大鼠血清的鞘脂類鞘氨醇、二氫鞘氨醇顯著升高,經(jīng)肝寶膠囊給藥干預(yù)后回調(diào)并趨于正常水平,可能是通過調(diào)節(jié)鞘脂代謝而起作用［13-14］。

4.3 花生四烯酸代謝 花生四烯酸一般不游離存在,而是以磷脂的形式酯化在細胞膜中,與空白組相比,模型組中花生四烯酸含量顯著上升,可能由于多種刺激因子激活磷脂酶A2,從而使花生四烯酸從膜磷脂中游離出來,誘發(fā)的炎癥反應(yīng)也可使細胞膜遭到破壞,同時花生四烯酸的代謝產(chǎn)物LXA4(脂氧素) 可激活A(yù)HR (芳香烴受體) 增加其靶基因CD36 的表達,增加肝細胞脂肪酸攝取和肝臟脂質(zhì)沉積［15-19］,經(jīng)肝寶膠囊給藥后,花生四烯酸有所回調(diào),可能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸的代謝,抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,起到減輕肝細胞的炎癥反應(yīng)作用。

綜上所述,肝寶膠囊對NAFLD 大鼠改善作用明顯,通過藥效作用、差異代謝物及代謝通路生物學意義分析,推測可能主要通過調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝、鞘脂代謝和花生四烯酸代謝等多成分多通路而發(fā)揮作用,從而為臨床上肝寶膠囊治療NAFLD 進一步奠定實驗基礎(chǔ)。