樊 君，喬 迪，陳 廣*

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032；2.昆明同仁醫(yī)院，云南 昆明 650000）

心肌炎,也稱為炎癥性心肌病,是一種出現(xiàn)在心肌肌層的局限性或彌漫性的炎癥性病變,青壯年發(fā)病較多［1］。病毒感染是心肌炎的最常見原因,其他病因還包括細(xì)菌感染、毒素、藥物反應(yīng)和自身免疫性疾病等［2］。臨床上,輕度患者無明顯癥狀,但是嚴(yán)重的患者可能會(huì)出現(xiàn)心力衰竭、心律失常甚至猝死［3］。目前,關(guān)于心肌炎仍無特異的治療方法,但最近的報(bào)道顯示中草藥可以改善心肌炎的癥狀,這些發(fā)現(xiàn)引起了研究者對探索傳統(tǒng)中草藥對心肌炎的影響的濃厚興趣［4］。大黃素(emodin) 是傳統(tǒng)中藥虎杖及掌葉大黃根莖中提取的有效活性成分,具有抗菌、抗氧化、降血壓、抗腫瘤及免疫抑制等藥理學(xué)功能。有研究顯示,大黃素能夠改善病毒性心肌炎患者的臨床癥狀,改善失代償期心肌炎患者的心臟功能［5］。最近,越來越多的證據(jù)表明大黃素具有抗病毒和抗菌特性,可以用作免疫增強(qiáng)劑抑制炎癥因子表達(dá)和炎癥損傷。例如,Liang 等報(bào)道,大黃素通過上調(diào)小鼠軟骨源性ATDC5 細(xì)胞的lncRNA TUG1 減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［6］。任凱旋等研究表明大黃素對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞具有抗炎的作用［7］。然而,大黃素對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用及其潛在機(jī)制尚不清楚。因此本項(xiàng)研究旨在探討大黃素對心肌炎的影響,通過構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞炎癥損傷模型,探究大黃素對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響及機(jī)制,以期為大黃素作為治療心肌炎的潛在治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠H9c2 心肌細(xì)胞(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；胎牛血清(美國Gibco 公司)；DMEM 培養(yǎng)基 (美國Invitrogen 公司)；大黃素、LPS、噻唑藍(lán)試劑(美國Sigma 公司)；TNF-α (批號(hào)ab100785)、IL-1β (批號(hào)ab100768)、IL-6 (批號(hào)ab100772) ELISA 檢測試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒(批號(hào)AD10-10,日本TaKaRa 公司)；PVDF 膜(美國密理博公司)；BCA 蛋白檢測試劑盒(批號(hào)P0006C)、ECL 電化學(xué)發(fā) 光試劑盒 (批 號(hào)P0018AS) (上海碧云天生物技術(shù)研究所)；NF-κB激動(dòng)劑佛波酯PMA (北京索萊寶科技有限公司)；NF-κB P65、IκB-α 抗體(美國CST 公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),于5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長匯合率達(dá)90%以上時(shí)進(jìn)行傳代,取生長狀態(tài)良好者用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理、分組 參考文獻(xiàn)［8］ 制備LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥模型,采用終濃度為1 μmol/L的LPS 干預(yù)心肌細(xì)胞,采用濃度為5、10、20 μmol/L 的大黃素干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞作為藥物干預(yù)組,實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、LPS 誘導(dǎo)組、LPS+低劑量大黃素組、LPS+中劑量大黃素組和LPS+高劑量大黃素組,各組心肌細(xì)胞處理24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步探究大黃素通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,本實(shí)驗(yàn)在C 組中添加終濃度為1 μmol/L的NF-κB 信號(hào)通路激動(dòng)劑PMA,記為PMA 組,處理24 h 后進(jìn)行后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT 法檢測心肌細(xì)胞存活率 將對數(shù)期的心肌細(xì)胞調(diào)整為1×104個(gè)/mL,取200 μL 細(xì)胞懸液接種到96 孔板中,放置在常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后除去細(xì)胞上清液,按照“1.3” 項(xiàng)下方法分為正常對照組、LPS 誘導(dǎo)組、LPS+低劑量大黃素組、LPS+中劑量大黃素組、LPS+高劑量大黃素組組,各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后向各孔細(xì)胞中加入20 μL 0.5 mg/L 的MTT 溶液,放置在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,除去上清液,再加入150 μL 二甲基亞砜,震蕩反應(yīng)10 min,在酶標(biāo)儀上測定各孔細(xì)胞的吸光度值(OD 值),計(jì)算細(xì)胞相對存活率,細(xì)胞相對存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值) ×100%。

1.5 ELISA 檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6水平 將心肌細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/mL,在96孔板中接種200 μL 細(xì)胞懸液,于常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞貼壁后吸去細(xì)胞上清液,按“1.3” 項(xiàng)下方法分組和處理,24 h 后收集細(xì)胞上清液,分別參照TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行各項(xiàng)處理,顯色反應(yīng)結(jié)束后使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度值 (A值),檢測TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率 心肌細(xì)胞按照上述“1.3” 項(xiàng)下方法分組和處理24 h 后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,以PBS 洗滌2 遍,收集約5×105個(gè)細(xì)胞,加入適量結(jié)合緩沖液重懸心肌細(xì)胞,向心肌細(xì)胞中分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和5 μL PI 染液,室溫避光孵育15 min,在1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot 檢測心肌細(xì)胞中蛋白水平 收集各組待測心肌細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min,離心后收集上清蛋白。使用BCA 法對提取的蛋白樣品進(jìn)行定量測定,在蛋白中加入上樣緩沖液,沸水中加熱致蛋白變性,取40 μg 變性蛋白加入到泳道孔中,行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,隨后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上,在5%脫脂奶粉中封阻2 h,洗膜后加入一抗孵育,NF-κB P65 和IκB-α 一抗均為1 ∶1 000 稀釋,置搖床上4 ℃低速振搖過夜,洗膜后加入1 ∶3 000 稀釋的二抗,置搖床上常溫低速振搖2 h。采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色,隨后轉(zhuǎn)移至暗室成像并采集圖像,以β-actin 為內(nèi)參,采用Image J 軟件分析目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,2 組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩組間比較采用SNK-q 分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素提高LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞相對存活率 與正常對照組比較,LPS 誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞相對存活率降低(P＜0.05)；與LPS 誘導(dǎo)組比較,LPS+低劑量大黃素、LPS+中劑量大黃素、LPS+高劑量大黃素組心肌細(xì)胞相對存活率升高(P＜0.05),并隨著劑量增加而更明顯(P＜0.05),見表1。

2.2 大黃素抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌炎癥因子 與正常對照組比較,LPS 誘導(dǎo)組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高(P＜0.05)；與LPS 誘導(dǎo)組比較,LPS+低劑量大黃素、LPS+中劑量大黃素、LPS+高劑量大黃素組三者水平降低(P＜0.05),并存在量效關(guān)系(P＜0.05),見表2。

2.3 大黃素抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡 與正常對照組比較,LPS 誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)；與LPS 誘導(dǎo)組比較,LPS+低劑量大黃素組、LPS+中劑量大黃素組、LPS+高劑量大黃素組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05),并存在量效關(guān)系(P＜0.05)。見表3、圖1。

表1 各組心肌細(xì)胞相對存活率比較（， n=9）Tab.1 Comparison of relative survival rates of myocardial cells among various groups （， n=9）

表1 各組心肌細(xì)胞相對存活率比較（， n=9）Tab.1 Comparison of relative survival rates of myocardial cells among various groups （， n=9）

注:與正常對照組比較,*P ＜0.05；與LPS 誘導(dǎo)組比較,＃P ＜0.05；與LPS+低劑量大黃素組比較,△P＜0.05；與LPS+中劑量大黃素組比較,◇P＜0.05。

表2 各組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（， n=9）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 levels among various groups （， n=9）

表2 各組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（， n=9）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 levels among various groups （， n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與LPS 誘導(dǎo)組比較,＃P＜0.05；與LPS+低劑量大黃素組比較,△P＜0.05；與LPS+中劑量大黃素組比較,◇P＜0.05。

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（， n=9）Tab.3 Comparison of apoptotic rates of myocardial cells among various groups （， n=9）

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（， n=9）Tab.3 Comparison of apoptotic rates of myocardial cells among various groups （， n=9）

注:與正常對照組比較,*P ＜0.05；與LPS 誘導(dǎo)組比較,＃P ＜0.05；與LPS+低劑量大黃素組比較,△P＜0.05；與LPS+中劑量大黃素組比較,◇P＜0.05。

2.4 大黃素抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路的激活 與正常對照組比較,LPS 誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞中NF-κB P65 表達(dá)上調(diào)(P＜0.05),IκB-α 表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)；與LPS 誘導(dǎo)組比較,LPS+低劑量大黃素組、LPS+中劑量大黃素組、LPS+高劑量大黃素組心肌細(xì)胞中NF-κB P65 表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),IκB-α 表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；與LPS+低劑量大黃素組比較,LPS+中劑量大黃素組和LPS+高劑量大黃素組心肌細(xì)胞中NF-κB P65 表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),IκB-α 表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；與LPS+中劑量大黃素組比較,LPS+高劑量大黃素組心肌細(xì)胞中NF-κB P65 表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),IκB-α 表達(dá)上調(diào)(P＜0.05),見圖2、表4。

圖1 各組心肌細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rates of myocardial cells in various groups

圖2 各組心肌細(xì)胞NF-κB P65、IκB-α 蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of NF-κB P65 and IκB-α in myocardial cells in various groups

表4 各組心肌細(xì)胞NF-κB P65、IκB-α 蛋白表達(dá)比較（， n=9）Tab.4 Comparison of protein expressions of NF-κB P65 and IκB-α in myocardial cells among various groups （， n=9）

表4 各組心肌細(xì)胞NF-κB P65、IκB-α 蛋白表達(dá)比較（， n=9）Tab.4 Comparison of protein expressions of NF-κB P65 and IκB-α in myocardial cells among various groups （， n=9）

注:與正常對照組比較,*P ＜0.05；與LPS 誘導(dǎo)組比較,＃P ＜0.05；與LPS+低劑量大黃素組比較,△P＜0.05；與LPS+中劑量大黃素組比較,◇P＜0.05。

2.5 NF-κB 激動(dòng)劑促進(jìn)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng) 與LPS+低劑量大黃素組比較,PMA 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高(P＜0.05),見表5。

表5 2 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（， n=9）Tab.5 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 levels between the two groups （， n=9）

表5 2 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（， n=9）Tab.5 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 levels between the two groups （， n=9）

注:與LPS+低劑量大黃素組比較,*P＜0.05。

2.6 NF-κB 激動(dòng)劑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡 與LPS+低劑量大黃素組組比較,PMA 組心肌細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05),見圖3、表6。

圖3 2 組心肌細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rates of myocardial cells in the two groups

表6 2 組心肌細(xì)胞凋亡率比較（， n=9）Tab.6 Comparison of apoptosis rates of myocardial cells between the two groups （， n=9）

表6 2 組心肌細(xì)胞凋亡率比較（， n=9）Tab.6 Comparison of apoptosis rates of myocardial cells between the two groups （， n=9）

注:與LPS+低劑量大黃素組比較,*P＜0.05。

3 討論

最近的研究證實(shí)了大黃素在多種情況下的抗炎作用,例如動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘和敗血癥等［9-11］。此外,已發(fā)現(xiàn)大黃素的抗炎作用是由抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起的［12］。但是,大黃素在LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中炎癥反應(yīng)及凋亡細(xì)胞的作用仍不清楚。因此,本研究的目的是闡明大黃素是否可以通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路來改善LPS 誘導(dǎo)的心肌炎。研究顯示,LPS 的降低與心臟病患者的預(yù)后改善相關(guān)［13］。在心肌細(xì)胞中,暴露于LPS 會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄因子的激活,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡反應(yīng)和炎性介質(zhì)(如TNF-α,IL-1β 和IL-6) 的產(chǎn)生［14］。因此,使用LPS 刺激H9c2 心肌細(xì)胞建立心肌炎模型可能有助于開發(fā)用于直接治療心肌炎的新型治療劑。在本研究中,根據(jù)以往研究何預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用濃度為1 μmol/L 的LPS 誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞,結(jié)果顯示心肌細(xì)胞相對存活率降低,凋亡細(xì)胞增加和促炎因子TNF-α,IL-1β 和IL-6 釋放增多,這與以前的研究相似。隨后,本實(shí)驗(yàn)探討了大黃素對LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥性損傷和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大黃素可以有效減輕LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,由于炎癥因子分泌和細(xì)胞凋亡減少。

核因子-κB (NF-κB) 是一種廣泛表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)多個(gè)重要的生理病理過程(包括心肌炎的炎癥過程) 中起著重要作用［15-18］。多項(xiàng)研究表明,NF-κB 信號(hào)通路是心肌炎和其他炎性疾病(包括關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、哮喘和肝炎) 的有希望的治療靶點(diǎn)［19-22］。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot 評(píng)估了NF-κB 的活化情況。結(jié)果表明,大黃素干預(yù)心肌細(xì)胞可導(dǎo)致NF-κB P65 表達(dá)上調(diào),IκB-α 表達(dá)下調(diào),提示大黃素能夠抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活。此外,本實(shí)驗(yàn)在大黃素干預(yù)的LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中添加NF-κB 信號(hào)通路激動(dòng)劑PMA,結(jié)果顯示,PMA 能夠逆轉(zhuǎn)大黃素對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

總之,目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大黃素可能通過抑制NF-κB 途徑來保護(hù)LPS 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡。此外,大黃素可以用作輔助治療,以減少心肌炎患者的心肌細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡。為了充分闡明其潛在機(jī)制,需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。