江 勇，朱大俠，劉禮劍

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421002）

重癥急性胰腺炎 (severe acute pancreatitis,SAP) 是一種臨床常見的急危重癥,其發(fā)病快、病變復(fù)雜、并發(fā)癥多且死亡率高,嚴(yán)重威脅著人類健康［1］。腸道是SAP 發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的中心器官,SAP 發(fā)生時(shí)大量炎癥因子釋放,使腸道出現(xiàn)微循環(huán)障礙,并伴隨免疫細(xì)胞大量凋亡,導(dǎo)致腸道免疫功能被抑制,腸屏障受損,腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位,最終造成胰腺壞死繼發(fā)腹腔感染,甚至誘發(fā)腹腔室隔綜合征和多器官衰竭綜合征,使胰腺炎病情加重［2-3］。

白術(shù)多糖是白術(shù)的重要組成成分,具有改善胃腸道功能［4］、調(diào)節(jié)免疫生物活性［5］、抗腫瘤［6］等作用,但有關(guān)白術(shù)多糖在重癥急性胰腺炎致腸黏膜免疫屏障損傷中的作用,還未曾報(bào)道。TLR4 (Toll樣受體) 是一類天然免疫模式識(shí)別受體,可活化NF-κB (核因子-κB) 并促進(jìn)其下游相關(guān)炎性因子的表達(dá)。在正常生理?xiàng)l件下TLR4/NF-κB 通路的活化可激活機(jī)體免疫應(yīng)答,然而在炎性病理?xiàng)l件下該通路的活化可引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有研究顯示［7］,TLR4/NF-κB 通路在SAP 介導(dǎo)的腸黏膜屏障功能障礙中可作為炎癥反應(yīng)的“閥門”,介導(dǎo)炎性介質(zhì)的釋放并引起SAP 各器官損傷。白術(shù)多糖是否通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與SAP 腸黏膜免疫屏障的調(diào)控,目前鮮有報(bào)道。為此,本研究擬通過胰膽管逆行注射?；悄懰徕c法建立SAP 大鼠模型,旨在探討白術(shù)多糖對(duì)急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的保護(hù)作用及其對(duì)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的影響,為其新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無特定病原體(SPF) 級(jí)雄性SD 大鼠60 只,鼠齡6～7 周,體質(zhì)量(250±20) g,由湖南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘) 2019-0023。飼養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度50%～70%,12 h/12 h 明暗交替,自由飲食攝水。

1.2 試劑與儀器 白術(shù)多糖(多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%,批號(hào)ZL180112133) 購于南京澤朗生物科技有限公司。注射用烏司他丁(批號(hào)C0018021) 購于廣東天普生化醫(yī)藥有限公司；牛膽酸鈉(批號(hào)20190203006)、蘇木素-伊紅 (HE) 染色試劑盒(批號(hào)C233029) 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白介素-1β (IL-1β,S009591)、白介素-6(IL-6,S006040)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α,S004441) ELISA 試劑盒購于美國R＆D 公司；大鼠分泌性免疫球蛋白A (sIgA) 放射免疫分析藥盒(批號(hào)S00569) 購于北京原子高科股份有限公司；TLR-4 (批 號(hào) GR109440-1)、MyD88 (批 號(hào)GR133612-2)、p-NF-κB p65 (Ser536) (批 號(hào)GR117656-1)、NF-κB p65 (批 號(hào)GR129871-4)、GAPDH 抗體購于英國Abcam 公司；熒光抗體APCCD3e (L40095)、CD4-PE (批號(hào)L10535)、CD8a-PE (批號(hào)L11306) 購于美國Biolegend 公司；石蠟切片機(jī)購于德國Leitz 公司；酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Science 公司；熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組 60 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分成5 組,假手術(shù)組、SAP 模型組、陽性藥物烏司他丁組、白術(shù)多糖低劑量組和白術(shù)多糖高劑量組,每組12 只。所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后,采用逆行膽胰管注射5%?；悄懰徕c溶液(0.1 mL/100 g,體積流量0.2 mL/min) 建立SAP 模型［8］,注射10 min 后可觀察到胰管走形區(qū)域的胰腺組織出現(xiàn)充血、水腫,且隨著時(shí)間延長紅腫面積逐漸擴(kuò)大,表明SAP 模型制作成功,即可逐層縫合并關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組大鼠僅行腹部切口,不注射牛磺膽酸鈉,在閉合腹部前稍微翻動(dòng)胰腺組織數(shù)次。造模成功后立即進(jìn)行藥物干預(yù),烏司他丁組大鼠通過腹腔注射2×104U/kg 烏司他丁,白術(shù)多糖低劑量組和白術(shù)多糖高劑量組大鼠分別通過腹腔注射200 mg/kg 和400 mg/kg 白術(shù)多糖,而假手術(shù)組和SAP 模型組大鼠注射等量生理鹽水,每天1 次,給藥48 h 后處死大鼠取材。

1.3.2 血清淀粉酶及炎癥因子水平檢測(cè) 腹主動(dòng)脈采血并分離血清,采用碘比色法檢測(cè)血清淀粉酶活性；采用ELISA 法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1.3.3 HE 染色觀察胰腺和小腸組織病理變化取胰腺組織和小腸組織,洗凈后用10% 福爾馬林固定,石蠟包埋后將石蠟塊4 μm 切片并行蘇木素-伊紅(HE) 染色,于顯微鏡下觀察病理改變,并采用Schmidt 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］對(duì)胰腺進(jìn)行病理評(píng)分,采用Chui’ s 評(píng)分法［10］對(duì)小腸組織進(jìn)行病理評(píng)分。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小腸腸黏膜中T 細(xì)胞亞群比例 取小腸組織,生理鹽水洗凈剪碎后加入消化酶,于恒溫水浴振蕩器中消化30 min 后經(jīng)濾網(wǎng)過濾,加入淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。取500 μL調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液于流式檢測(cè)管中,加入APC-CD3e、PE-CD4 和PE-CD8a 抗體,室溫下避光孵育20 min,1 000 r/min 離心10 min,棄上清,加入PBS 緩沖液重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以CD3e+CD4+雙陽性細(xì)胞亞群百分比表示CD4+T 細(xì)胞所占比例,以CD3e+CD8+雙陽性細(xì)胞亞群表示CD8+T 細(xì)胞所占比例,并計(jì)算CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值。

1.3.5 放射免疫法檢測(cè)小腸黏膜中sIgA 水平 取小腸組織,生理鹽水清洗后,以10% 醋酸溶液沖洗腸腔并收集灌洗液,4 ℃條件下20 000 r/min 離心30 min,收集上清液,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用放射免疫分析法檢測(cè)slgA 水平。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)小腸組織中TLR-4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組大鼠小腸組織置于組織勻漿器內(nèi),加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑于冰上碾磨勻漿,12 000 r/min,4 ℃離心20 min,取上清。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度,取25 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和GAPDH 抗體,4 ℃孵育過夜,次日加入相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h,ECL 試劑曝光顯影,在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn),以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)多糖對(duì)SAP 大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平的影響 如表1 所示,與假手術(shù)組比較,SAP模型組大鼠血清中淀粉酶活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6 水平增加(P＜0.01)；與SAP 模型組比較,白術(shù)多糖高劑量組和烏司他丁組血清中淀粉酶活性及TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低(P＜0.01),而白術(shù)多糖低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 白術(shù)多糖對(duì)SAP 大鼠胰腺及小腸組織病理學(xué)的影響 如圖1 所示,假手術(shù)組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)正常,無水腫,無炎性細(xì)胞浸潤；SAP 模型組和白術(shù)多糖低劑量組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,間質(zhì)水腫,大量炎癥細(xì)胞浸潤；白術(shù)多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠胰腺病理特征較SAP 模型組明顯改善,可觀察到胰腺組織炎癥浸潤水平降低,間質(zhì)水腫程度減輕,胰腺結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整。如圖2 所示,假手術(shù)組大鼠小腸黏膜絨毛排布規(guī)整,刷狀緣光整平滑,未見明顯損傷；SAP 模型組和白術(shù)多糖低劑量組大鼠小腸黏膜破損嚴(yán)重,小腸黏膜絨毛水腫、萎縮變形、排列紊亂,局部灶性壞死；白術(shù)多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠小腸絨毛形態(tài)較SAP 模型組相對(duì)完整,各層結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰完整。如表2 所示,與假手術(shù)組比較,SAP 模型組大鼠胰腺組織Schmidt 評(píng)分和小 腸組織Chui’s 評(píng)分增加 (P＜0.01)；與SAP 模型組比較,白術(shù)多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠胰腺組織Schmidt 評(píng)分和小腸組織Chui’s 評(píng)分降低(P＜0.01),而白術(shù)多糖低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較（， n=12）Tab.1 Comparison of serum levels of amylase and inflammatory factors in rats among various groups （， n=12）

表1 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較（， n=12）Tab.1 Comparison of serum levels of amylase and inflammatory factors in rats among various groups （， n=12）

注:與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與SAP 模型組比較,＃＃P＜0.01。

圖1 各組大鼠胰腺組織切片病理變化（HE 染色，×200）Fig.1 Pathological changes of pancreas tissue sections of rats in various groups （HE staining，×200）

圖2 各組大鼠小腸組織切片病理觀察（HE 染色，×200）Fig.2 Pathological changes of small intestine tissue sections in rats in various groups （HE staining，×200）

表2 各組大鼠胰腺和小腸組織病理學(xué)評(píng)分（， n=12）Tab.2 Pathological scores of small intestine tissue and pancreas of rats in various groups （， n=12）

表2 各組大鼠胰腺和小腸組織病理學(xué)評(píng)分（， n=12）Tab.2 Pathological scores of small intestine tissue and pancreas of rats in various groups （， n=12）

注:與假手術(shù)組比較,** P ＜0.01；與SAP 模型組比較,＃＃P＜0.01。

2.3 白術(shù)多糖對(duì)SAP 模型大鼠小腸黏膜中T 細(xì)胞亞群比例及sIgA 水平的影響 如表3 所示,與假手術(shù)組比較,SAP 模型組大鼠小腸黏膜中CD4+T細(xì)胞亞群比例及CD4+/CD8+比值和sIgA 水平降低(P＜0.01),而CD8+T 細(xì)胞亞群比例升高 (P＜0.01)；與SAP 模型組比較,白術(shù)多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠小腸黏膜CD4+T 細(xì)胞亞群比例及CD4+/CD8+比 值、sIgA 水平增加 (P＜0.01),CD8+T 細(xì)胞亞群比例降低(P＜0.01)；白術(shù)多糖低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。

表3 各組大鼠腸黏膜中T 細(xì)胞亞群比例及sIgA 水平比較（， n=12）Tab.3 Comparison of T cell subsets and sIgA levels in intestinal mucosa of rats among various groups （， n=12）

表3 各組大鼠腸黏膜中T 細(xì)胞亞群比例及sIgA 水平比較（， n=12）Tab.3 Comparison of T cell subsets and sIgA levels in intestinal mucosa of rats among various groups （， n=12）

注:與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與SAP 模型組比較,＃＃P＜0.01。

2.4 白術(shù)多糖對(duì)SAP 大鼠小腸組織中TLR-4/NFκB 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示,與假手術(shù)組比較,SAP 模型組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65 水平升高(P＜0.01),而NF-κB p65 蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)；與SAP 模型組比較,白術(shù)多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65 水平降低(P＜0.01),NF-κB p65 蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05),而白術(shù)多糖低劑量組與SAP模型組比較以上蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。

圖3 各組大鼠小腸組織TLR-4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 （Ser536） 蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expressions of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 and p-NF-κB p65 （Ser536） in small intestine of rats in various groups

3 討論

在SAP 的發(fā)病過程中,胰腺細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 等,這些炎癥因子之間相互作用,導(dǎo)致促炎與抗炎細(xì)胞因子系統(tǒng)失衡,引發(fā)全身炎癥反應(yīng)［11］。免疫球蛋白sIgA 主要存在于黏膜上層的黏液中,是黏膜局部免疫反應(yīng)的主要抗體,sIgA 水平下降表示局部免疫功能下降,而sIgA 分泌減少可降低腸道抵御細(xì)菌和毒素入侵的能力,且易激活細(xì)胞炎性因子,產(chǎn)生過度炎性反應(yīng),進(jìn)一步損害腸黏膜［12］。血清淀粉酶是SAP 診斷中最常用的生化標(biāo)志物。姚金鋒［13］等人研究顯示,SAP 大鼠胰腺組織出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng),腸黏膜組織受到破壞,血清淀粉酶活性明顯上升,同時(shí)小腸黏膜sIgA 水平顯著下調(diào)。本研究結(jié)果顯示,高劑量白術(shù)多糖可降低SAP 大鼠血清中淀粉酶活性以及炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平,下調(diào)腸黏膜中sIgA 水平,說明白術(shù)多糖可以通過降低腸道黏膜通透性、改善腸道免疫屏障功能起到保護(hù)SAP 大鼠腸道黏膜的作用。

CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞和CD4+T/CD8+T 值的改變代表機(jī)體免疫功能的改變,一定程度上也是反映SAP 損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)［14］。Liu 等［15］人在對(duì)76 名SAP 患者的研究中發(fā)現(xiàn),患者外周血中CD4+T 細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值較正常人明顯下調(diào)；Wang［16］研究SAP 大鼠腸道免疫功能的變化發(fā)現(xiàn),SAP 發(fā)生后CD4+T、CD4+T/CD8+T 比值明顯下降,CD8+T 細(xì)胞比例上調(diào),說明大鼠早期即發(fā)現(xiàn)腸黏膜免疫功能明顯下降。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,SAP 模型組大鼠小腸黏膜中CD4+T 細(xì)胞亞群比例和CD4+/CD8+比值降低,而CD8+T 細(xì)胞亞群比例顯著升高,與前人研究一致,而高劑量白術(shù)多糖治療組大鼠腸黏膜中CD4+T細(xì)胞亞群比例、CD4+/CD8+比值明顯回升,而CD8+T 細(xì)胞亞群比例明顯下調(diào),說明白術(shù)多糖可以通過改善機(jī)體T 細(xì)胞亞群免疫功能,減輕腸道炎癥反應(yīng)和損傷,進(jìn)而起到保護(hù)腸黏膜免疫屏障的作用。

TLR4/NF-κB 通路是近些年來發(fā)現(xiàn)與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)的信號(hào)通路,NF-κB 的異?；罨鹧仔约?xì)胞因子的失控釋放,是導(dǎo)致胰腺外損傷的重要機(jī)制［17］。NF-κB 信號(hào)通路受多種上游信號(hào)分子刺激而激活,TLR4 是其中之一。有研究顯示［18］,SAP 時(shí)內(nèi)毒素進(jìn)入血液,其結(jié)構(gòu)成分脂多糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面被TLR4 識(shí)別后啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),使NF-κB 從胞漿轉(zhuǎn)到核內(nèi),誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β 等的合成,破壞腸黏膜屏障。本研究Western blot 結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,SAP 模型組大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白以及p-NF-κB p65 水平均顯著上升,與蘭濤等［19］研究一致,而高劑量白術(shù)多糖干預(yù)組能降低大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白和p-NF-κB p65 表達(dá)水平,由此可以推測(cè)SAP 誘導(dǎo)的腸黏膜免疫屏障損傷與TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活有關(guān),而白術(shù)多糖可以通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)活化,保護(hù)SAP大鼠腸黏膜免疫屏障功能不受損傷。

綜上所述,白術(shù)多糖可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,減輕SAP 大鼠炎癥反應(yīng),提高腸道sIgA 水平,增加腸黏膜中T 細(xì)胞亞群比例,改善胰腺組織和小腸組織病理損傷,保護(hù)腸黏膜免疫屏障。