劉明宗，劉于嵩，龍國(guó)利，張 釗，江宇虹，高榕茂

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院ICU，四川成都 610100；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院檢驗(yàn)科，四川 成都 610100；3.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

急性肺損傷(acute lung injury,ALI) 和急性呼吸窘迫綜合征 (acute respiratory distress syndrome,ARDS) 是一種臨床常見病和潛在致死綜合征,以肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加和過度炎癥反應(yīng)為特征［1-2］。近年來,盡管在呼吸生理學(xué)方面取得進(jìn)展,但ALI/ARDS 死亡率仍居高不下。因此,有效控制肺泡上皮細(xì)胞異常炎癥和凋亡對(duì)改善ALI/ARDS 患者預(yù)后具有重要意義。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP) 又叫四甲基吡嗪,是從中藥川芎Ligusticum chuanxiongHort.中提取的化合物,其除具有血管舒張和抗血小板活性外,還具抗氧化、抗炎作用,可減輕脂多糖或低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷［3-5］,但川芎嗪對(duì)肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用及潛在機(jī)制并未闡明。miR-31 是一種炎性相關(guān)微小RNA (microRNA,miRNA),其表達(dá)異常與糖尿病腎病、脊髓損傷等疾病進(jìn)展有關(guān)［6-7］。生物信息學(xué)分析顯示內(nèi)皮素受體B (endothelin receptor B,Ednrb) 是miR-31-5p的潛在靶基因。Ednrb 在慢阻肺患者中表達(dá)增加,抑制Ednrb 表達(dá)通過抑制炎癥反應(yīng)可抑制慢阻肺進(jìn)展［8］。于是推測(cè)川芎嗪對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的抗炎和抗凋亡作用可能與調(diào)控miR-31-5p/Ednrb 通路有關(guān)。因此,本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 體外誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B 構(gòu)建炎癥模型［9］,探討川芎嗪對(duì)miR-31-5p和Ednrb 表達(dá)以及BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響,以期為川芎嗪在ALI/ARDS 輔助治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2 試劑 杜爾伯格伊戈?duì)柵囵B(yǎng)液(DMEM)、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司；脂多糖購(gòu)于美國(guó)Sigma 公 司。川芎嗪 (純 度≥98%,批 號(hào)20181012) 購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。模擬物對(duì)照(miR-con)、miR-31-5p模擬物(miR-31-5pmimics)、小干擾RNA 對(duì)照(si-con)、Ednrb 小干 擾 RNA (si-Ednrb)、Ednrb 過表達(dá)載 體(pcDNA-Ednrb)、空載體質(zhì)粒(pcDNA)、miRNA抑制物對(duì)照 (anti-miR-con)、miR-31-5p抑制物(anti-miR-31-5p) 由南京金斯瑞生物科技有限公司提供；膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素(Annexin VFITC)/碘化丙啶(PI) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20181213)、Trizol 試劑(批號(hào)20190105)、二喹啉甲酸(BCA) 試劑盒(批號(hào)20190215) 購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α) (批號(hào)20181205)、白細(xì)胞介素1β (IL-1β)、白細(xì)胞介素6 (IL-6) (批號(hào)20190121) 酶連免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；兔源Ednrb (批號(hào)20190201)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3) (批號(hào)20181211)、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2) (批號(hào)20190207)、Bcl-2相關(guān)X 蛋白(Bax) (批號(hào)20190217)、β-actin 抗體(批號(hào)20181225)、山羊抗兔Ⅱ抗 (批號(hào)20181114) 購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,2 組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間進(jìn)一步比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 采用DMEM 培養(yǎng)基(含10% 的胎牛血清) 常規(guī)培養(yǎng)BEAS-2B 細(xì)胞,48 h顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL,按照2 mL/孔接種到6 孔板,實(shí)驗(yàn)分組如下。對(duì)照組:正常培養(yǎng)的BEAS-2B 細(xì)胞。LPS組:采用終濃度為1 μg/mL 的LPS 處理BEAS-2B細(xì)胞24 h。LPS+川芎嗪5 μmol/L 組、LPS+川芎嗪20 μmol/L 組、LPS+川芎嗪80 μmol/L 組:采用終濃度為5、20、80 μmol/L 的川芎嗪作用2 h 后,給予1 μg/mL 的LPS 刺激24 h。LPS+miR-con 組、LPS+miR-31-5p 組、LPS+si-con 組、LPS+si-Ednrb組:利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 將miR-con、miR-31-5pmimics、si-con、si-Ednrb 分別轉(zhuǎn)染BEAS-2B 細(xì)胞后按照上述方式進(jìn)行LPS 刺激。LPS+川芎嗪+pcDNA 組、LPS+川芎嗪+pcDNA-Ednrb組:將pcDNA、pcDNA-Ednrb 分別轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞后按照上述方式進(jìn)行川芎嗪(80 μmol/L) 和LPS 處理。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集按照上述方式進(jìn)行干預(yù)處理的各組細(xì)胞,PBS 液洗滌細(xì)胞2次,加入結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液加入到流式管,按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書分別加入5 μL 的Annexin VFITC 和5 μL 的PI,室溫條件避光孵育15 min,隨后立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.3 ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平 各組細(xì)胞上述方式進(jìn)行干預(yù)處理后,吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清,采用ELISA 試劑盒分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量。步驟如下:向反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μL 的待檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,空白孔調(diào)零后,于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

2.4 RT-qPCR 檢測(cè)miR-31-5p和EdnrbmRNA 表達(dá) 收集按照上述方式進(jìn)行干預(yù)處理的各組細(xì)胞,參照Trizol 說明書提取各組細(xì)胞總RNA,采用DNA 酶除去DNA 影響后,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。合成PCR 引物進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。引物序列分別為miR-31-5p正向5′-GCGCAGGCAAGATGCTGG-3′,反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反 向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；Ednrb正 向5′-GGTTGTGTCCTGCCTTGTGTT-3′,反向5′-TTCGCATGCACTTGTTCTTGT-3′；β-actin正 向 5′-AAGATGA-CCCAGATCATGTTTGAG-3′,反 向 5′-TAGATGGGCACAGTGTGGGTG-3′。以cDNA 為 模板,采用SYBR 染料進(jìn)行標(biāo)記,于ABI 7500 上進(jìn)行PCR 檢測(cè)。分別以U6 和β-actin為內(nèi)參,按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-31-5p和EdnrbmRNA 表達(dá)水平。

2.5 Western blot 檢測(cè)Ednrb、Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞上述方式進(jìn)行干預(yù)處理后,BCA 法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣本和5×上樣緩沖液混合1 ∶4 混合配置上樣終液,100 ℃變性3 min,按照每孔到30 μg 細(xì)胞蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜后將膜置于5%的脫脂牛奶中室溫條件封閉1 h,加入稀釋的Ⅰ抗后4 ℃?zhèn)葦[搖床孵育過夜,回收Ⅰ抗后,TBST 洗膜3次,每次10 min。然后加入稀釋的Ⅰ抗室溫孵育2 h,TBST 洗膜3 次,每次10 min。配制化學(xué)發(fā)光顯色液暗室內(nèi)顯色,ImageJ 軟件分析目的條帶的灰度值。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-31-5p靶向調(diào)控 Ednrb 表達(dá)生物信息學(xué)分析工具Targetscan 預(yù)測(cè)顯示miR-31-5p與Ednrb 的3’ -UTR區(qū)域存在部分特異性結(jié)合的核苷酸序列,推測(cè)miR-31-5p 可能靶向調(diào)控Ednrb 表達(dá)并進(jìn)行驗(yàn)證。含有Ednrb 的3’ -UTR 的野生型熒光素酶報(bào)告基因載體(WT-Ednrb) 和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體(MUT-Ednrb) 由上海吉瑪制藥公司構(gòu)建。將miR-con、miR-31-5pmimics 分別與WT-Ednrb、MUT-Ednrb 共轉(zhuǎn)染至BEAS-2B 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的熒光素酶活性。為驗(yàn)證miR-31-5p 對(duì)Ednrb 的調(diào)控作用,分別將miR-con、miR-31-5pmimics、anti-miRcon、anti-miR-31-5p轉(zhuǎn) 染 BEAS-2B 細(xì) 胞,轉(zhuǎn) 染48 h,按“2.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定Ednrb 蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪抑制BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌 與對(duì)照組比較,LPS 組BEAS-2B 細(xì)胞Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)增加,Bcl-2 蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α 的濃度增加(P＜0.01)；與LPS 組比較,LPS+川芎嗪5 μmol/L 組、LPS+川芎嗪20 μmol/L組、LPS +川芎嗪80 μmol/L 組BEAS-2B 細(xì)胞Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)降低,Bcl-2 蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡率降低,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度降 低 (P＜0.05,P＜0.01)。見表1、圖1。

表1 川芎嗪抑制BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌（， n=9）Tab.1 BEAS-2B inhibited cell apoptosis and inflammatory factor secretion by TMP （， n=9）

表1 川芎嗪抑制BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌（， n=9）Tab.1 BEAS-2B inhibited cell apoptosis and inflammatory factor secretion by TMP （， n=9）

注:與對(duì)照組比較,**P＜0.01；與LPS 組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。

圖1 川芎嗪抑制BEAS-2B 細(xì)胞凋亡Fig.1 TMP inhibited BEAS-2B cell apoptosis

3.2 川芎嗪影響B(tài)EAS-2B 細(xì)胞miR-31-5p 和Ednrb基因及蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較,LPS 組BEAS-2B細(xì)胞miR-31-5p 表達(dá)降低,EdnrbmRNA 和Ednrb 蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)；與LPS 組比較,LPS+川芎嗪5 μmol/L 組、LPS+川芎嗪20 μmol/L組、LPS+川芎嗪80 μmol/L 組BEAS-2B 細(xì)胞miR-31-5p表達(dá)升高,EdnrbmRNA 和Ednrb 蛋白表達(dá)降低 (P＜0.05,P＜0.01)。見表2、圖2。

表2 川芎嗪影響B(tài)EAS-2B 細(xì)胞miR-31-5p 和Ednrb 基因表達(dá)（， n=9）Tab.2 TMP impacts gene expressions of miR-31-5p and Ednrb in BEAS-2B cells （， n=9）

表2 川芎嗪影響B(tài)EAS-2B 細(xì)胞miR-31-5p 和Ednrb 基因表達(dá)（， n=9）Tab.2 TMP impacts gene expressions of miR-31-5p and Ednrb in BEAS-2B cells （， n=9）

注:與對(duì)照組比較,**P＜0.01；與LPS 組比較,＃＃P＜0.01。

3.3miR-31-5p靶向調(diào)控Ednrb 表達(dá) 采用生物信息學(xué)分析工具Targetscan 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-31-5p、Ednrb 之間存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列,見圖3A。雙熒光素酶報(bào)告顯示,與miR-con和WT-Ednrb 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-31-5p和WTEdnrb 共轉(zhuǎn)染組BEAS-2B 細(xì)胞熒光素酶活性降低(P＜0.01)；與miR-con 和MUT-Ednrb 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-31-5p 和MUT-Ednrb 共轉(zhuǎn)染組BEAS-2B 細(xì)胞熒光素酶活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表3。上 調(diào)miR-31-5p表達(dá)后,BEAS-2B 細(xì) 胞Ednrb 蛋白表達(dá)降低；下調(diào)miR-31-5p 表達(dá)后BEAS-2B 細(xì)胞Ednrb 蛋白表達(dá)增加(P＜0.01),見表4、圖3B。

圖2 Western blot 檢測(cè)BEAS-2B 細(xì)胞中Ednrb 蛋白表達(dá)Fig.2 Detection of expressions of Ednrb protein in BEAS-2B cells by Western blot

圖3 miR-31-5p 靶向調(diào)控Ednrb 表達(dá)Fig.3 Targeted regulation on Ednrb expression by miR-31-5p

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（， n=9）Tab.3 Report of Dual luciferase experiment （， n=9）

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（， n=9）Tab.3 Report of Dual luciferase experiment （， n=9）

注:與miR-con 組比較,**P＜0.01。

表4 miR-31-5p 調(diào)控Ednrb 蛋白表達(dá)（， n=9）Tab.4 Regulation of Ednrb protein expression by miR-31-5p （， n=9）

表4 miR-31-5p 調(diào)控Ednrb 蛋白表達(dá)（， n=9）Tab.4 Regulation of Ednrb protein expression by miR-31-5p （， n=9）

注:與miR-con 組比較,** P ＜0.01；與anti-miR-con 組比較,＃＃P＜0.01。

3.4 過表達(dá)miR-31-5p對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 與LPS+miR-con 組比較,LPS+miR-31-5p組BEAS-2B 細(xì)胞miR-31-5p表達(dá)升高,Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)降低,Bcl-2蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡率降低,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度降低(P＜0.01)。見表5、圖4。

表5 過表達(dá)miR-31-5p 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響（， n=9）Tab.5 Effects of miR-31-5p overexpression on BEAS-2B cell apoptosis and inflammatory factor secretion （， n=9）

表5 過表達(dá)miR-31-5p 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響（， n=9）Tab.5 Effects of miR-31-5p overexpression on BEAS-2B cell apoptosis and inflammatory factor secretion （， n=9）

注:與LPS+miR-con 組比較,**P＜0.01。

圖4 過表達(dá)miR-31-5p 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響Fig.4 Effects of miR-31-5p overexpression on apoptosis and secretion of inflammatory factors in BEAS-2B cells

3.5 沉默Ednrb 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 與LPS+si-con 組比較,LPS+si-Ednrb組BEAS-2B 細(xì)胞Ednrb 蛋白表達(dá)降低,Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)降低,Bcl-2 蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡率降低,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平降低(P＜0.01),見表6、圖5。

表6 沉默Ednrb 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響（， n=9）Tab.6 Effects of silencing Ednrb on BEAS-2B cell apoptosis and secretion of inflammatory factors （， n=9）

表6 沉默Ednrb 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響（， n=9）Tab.6 Effects of silencing Ednrb on BEAS-2B cell apoptosis and secretion of inflammatory factors （， n=9）

注:與LPS+si-con 組比較,**P＜0.01。

圖5 沉默Ednrb 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響Fig.5 Effects of Ednrb silencing on BEAS-2B cell apoptosis and secretion of inflammatory factors

3.6 過表達(dá)Ednrb 部分逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 與LPS+川芎嗪+pcDNA 組比較,LPS+川芎嗪+pcDNA-Ednrb 組BEAS-2B 細(xì)胞 Ednrb 蛋白表達(dá)升高,Cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)增加,Bcl-2 蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平增加(P＜0.01),見表7、圖6。

表7 過表達(dá)Ednrb 部分逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響（， n=9）Tab.7 Partially reversed TMP’ s effects on apoptosis and secretion of inflammatory factors in BEAS-2B cells by Ednrb overexpression （， n=9）

表7 過表達(dá)Ednrb 部分逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響（， n=9）Tab.7 Partially reversed TMP’ s effects on apoptosis and secretion of inflammatory factors in BEAS-2B cells by Ednrb overexpression （， n=9）

注:與LPS+川芎嗪+pcDNA 組比較,**P＜0.01。

圖6 過表達(dá)Ednrb 部分逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響Fig.6 Partially reversed TMP’s effects on apoptosis and secretion of inflammatory factors in BEAS-2B cells by Ednrb overexpression

4 討論

川芎嗪是川芎提取物的主要活性成分之一,近年來其除用于心腦血管疾病治療外,其在肺損傷中的潛在作用也被逐步揭示。Liu 等［10］研究顯示川芎嗪可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,對(duì)膿毒癥誘發(fā)的ALI 具有治療作用；Meng 等［11］研究指出川芎嗪可能通過減弱細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)鈍性胸外傷所致的肺損傷；此外,川芎嗪還可提高機(jī)體抗氧化能力活性保護(hù)肺組織免受燙傷所致的傷害［12］。與上述保護(hù)作用一致,本研究顯示川芎嗪干預(yù)可下調(diào)促凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Bax 表達(dá),上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá),減輕LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B 細(xì)胞凋亡。TNF-α 是ALI 中重要的細(xì)胞因子,其可誘導(dǎo)IL-6 的釋放,增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附,加劇機(jī)體炎癥反應(yīng),抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌可減輕ALI 大鼠肺部損傷［13］。本研究顯示川芎嗪干預(yù)可減輕LPS 誘導(dǎo)的BEAS-2B 細(xì)胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌,抑制BEAS-2B 細(xì)胞炎癥反應(yīng)。提示川芎嗪通過抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)發(fā)揮ALI/ARDS 治療作用。

miR-31 是一種具有多效作用的miRNA,在食管鱗癌［14］、宮頸癌［15］、結(jié)直腸癌［16］等多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)發(fā)揮癌基因作用。在結(jié)腸炎中miR-31 表達(dá)上調(diào),結(jié)腸內(nèi)給予miR-31 抑制劑恢復(fù)抗炎因子IL-25 表達(dá)阻斷Th1/Th17 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是一種潛在的克羅恩病治療方法［18］。然而,在2 型糖尿病性腎病患者中miR-31 表達(dá)降低,且miR-31 表達(dá)與白細(xì)胞黏附、炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌呈負(fù)相關(guān),血清miR-31 水平是2 型糖尿病性腎病的潛在生物標(biāo)志物［5］。Targetscan 靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-31-5p與Ednrb之間存在相互作用,研究顯示慢性阻塞性肺病患者Ednrb 表達(dá)明顯升高,南蛇藤醇通過抑制Ednrb/Kng1 信號(hào)通路抑制香煙煙霧引起的細(xì)胞炎癥,減輕慢性阻塞性肺疾病。但miR-31-5p/Ednrb 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響尚未可知。LPS 干預(yù)后檢測(cè)miR-31-5p和Ednrb 表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR-31-5p表達(dá)降低,Ednrb 表達(dá)升高,而川芎嗪呈劑量依賴性地抑制LPS 誘導(dǎo)的Ednrb 表達(dá),促進(jìn)miR-31-5p表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p靶向負(fù)性調(diào)控Ednrb 表達(dá),過表達(dá)miR-31-5p 或沉默Ednrb 均可減輕LPS 誘導(dǎo)的BEAS-2B 細(xì)胞凋亡以及促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌,與川芎嗪的作用一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Ednrb 可部分逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。這些結(jié)果表明川芎嗪對(duì)LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與調(diào)控miR-31-5p/Ednrb 通路有關(guān)。

綜上所述,川芎嗪通過上調(diào)miR-31-5p/Ednrb通路抑制人肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B 凋亡和炎癥反應(yīng),為其在ALI/ARDS 輔助治療中的應(yīng)用奠定理論依據(jù)。