熱米萊·塔衣爾，買爾旦·玉蘇甫，徐勤偉，王阿西，阿力婭·吐遜江，池峙瑾，周文婷

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.隸屬小檗科小檗屬,在新疆喀什地區(qū)野生生長(zhǎng),偶有種植,其果實(shí)可藥食兩用,具有活血、利膽、防治高血壓以及抗炎等功效［1］。小檗屬植物具有較高的藥用價(jià)值,其根、根莖和根皮均為常見用藥部位。然而近年來,對(duì)于藥用植物非藥用部位的研究開發(fā)受到了不少學(xué)者的關(guān)注。以往藥用植物傳統(tǒng)的藥用部位被廣泛應(yīng)用,而非藥用部位往往被廢棄。研究表明,藥用植物非藥用部位常具有與藥用部位類似的化學(xué)基礎(chǔ),同樣具有較好的生物活性。因此,研究非藥用部位,對(duì)于發(fā)展新藥物、擴(kuò)大藥用部位、綜合利用藥材資源,從而加強(qiáng)非藥用部位的應(yīng)用與開發(fā),實(shí)現(xiàn)中藥的可持續(xù)發(fā)展有重要的意義［2-3］。目前有關(guān)喀什小檗的研究主要集中在果實(shí),對(duì)非傳統(tǒng)藥用部位喀什小檗葉的研究報(bào)道甚少,大量葉資源未開發(fā)利用。因此,本研究擬通過采用離體血管灌流實(shí)驗(yàn)方法,觀察喀什小檗葉是否具有舒張血管活性,并篩選有效部位,進(jìn)一步對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,旨在為研究開發(fā)喀什小檗葉的藥用價(jià)值奠定一定研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Power Lab 生物信號(hào)處理系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments 公司)；四通道橋式放大器(澳大利亞AD Instruments 公司)；LE01046 型恒溫離體組織器官灌流儀(西班牙Pan lab 公司)；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；X205BDU 型電子天平(瑞士梅特勒-儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 喀什小檗葉采集自新疆喀什地區(qū),由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為小檗科小檗屬喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.的葉；去氧腎上腺素 (PE,阿拉丁試劑有限公司,批號(hào)H1420012)；乙酰膽堿(Ach；美國(guó)Sigma 公司,批號(hào)BCBR3 675 V)；N-硝 基-L-精氨酸甲 酯 (LNAME；美國(guó)Sigma 公司,批號(hào)WXBC6 454 V)。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Kreb-Henseleit (K-H)液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L,pH 7.4)。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,體質(zhì)量200～250 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (新) 2018-0003。

2 方法

2.1 喀什小檗葉不同萃取部位的制備 取喀什小檗葉0.5 kg,按照料液比1 ∶10 加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇,回流提取3 次,每次2 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮,真空干燥,可得喀什小檗葉乙醇提取物浸膏,1 g 浸膏相當(dāng)于3.70 g 原藥材。用1 000 mL 蒸餾水溶解一部分乙醇提取物,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取多次至萃取完全,將所得到的各萃取液分別合并,減壓濃縮,真空干燥,可得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各萃取部位用含0.2%二甲基亞砜(DMSO) 的K-H 液溶解(已有文獻(xiàn)報(bào)道0.2% DMSO 對(duì)血管張力無影響［4］)。

2.2 大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的制備［5］頸椎脫臼處死SD 大鼠,迅速打開胸腔,取出胸主動(dòng)脈并置于4 ℃預(yù)冷K-H 液中(用95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和),小心清除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織后,剪成長(zhǎng)度3 mm 左右的4 個(gè)血管環(huán)。操作過程中避免過度牽拉,以防損傷至動(dòng)脈失活。去內(nèi)皮血管環(huán),用牙簽輕輕地來回滾動(dòng)血管環(huán)內(nèi)表面去除內(nèi)皮細(xì)胞來制備,未去除內(nèi)皮細(xì)胞的血管環(huán)為內(nèi)皮完整血管環(huán)。將血管環(huán)一端固定于具有10 mL K-H 液的浴槽中(浴槽內(nèi)K-H 液溫度恒溫37 ℃,持續(xù)不斷的通入95% O2和5% CO2混合氣體),一端連于張力換能器,用Power Lab 生物信號(hào)處理系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力的變化。血管環(huán)起始張力在1.0 g 狀態(tài)下穩(wěn)定60 min,每15 min 換1 次K-H 液。用1 μmol/L PE 預(yù)收縮血管環(huán),待血管環(huán)張力穩(wěn)定后給予10 μmol/L 的Ach 舒張血管環(huán)以檢查血管環(huán)內(nèi)皮的完整性,舒張率達(dá)到75%以上判斷為內(nèi)皮完整,小于15%可認(rèn)為是去內(nèi)皮血管。計(jì)算公式如下。

2.3 喀什小檗葉不同萃取部位對(duì)PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)的舒張作用 以1 μmol/L PE 預(yù)收縮各浴槽內(nèi)的內(nèi)皮完整血管環(huán),采用累計(jì)給藥法往各浴槽內(nèi)分別加入喀什小檗葉不同萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位),使不同萃取部位終濃度依次達(dá)到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次藥,記錄血管環(huán)張力的變化?？瞻捉M以等容K-H 液(含0.2% DMSO) 代替喀什小檗葉不同萃取部位,并于給藥組相同的時(shí)間記錄血管環(huán)張力的變化。

2.4 喀什小檗葉不同萃取部位對(duì)PE 預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用 以1 μmol/L PE 預(yù)收縮各浴槽內(nèi)的去內(nèi)皮血管環(huán),采用累計(jì)給藥法往各浴槽內(nèi)分別加入喀什小檗葉不同萃取部位(乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位),使不同萃取部位終濃度依次達(dá)到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次藥,記錄血管環(huán)張力的變化。空白組以等容K-H 液(含0.2% DMSO) 代替喀什小檗葉不同萃取部位,并與給藥組相同的時(shí)間記錄血管環(huán)張力的變化。

2.5L-NAME 對(duì)喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用的影響 將內(nèi)皮完整血管環(huán)分兩組,分別為L(zhǎng)-NAME 組和乙酸乙酯部位組。L-NAME 組用LNAME (100 μmol/L) 孵育20 min,乙酸乙酯部位組加等容K-H 液孵育20 min,然后用PE(1 μmol/L) 預(yù)收縮各組血管環(huán),再往各組浴槽內(nèi)分別逐步加入喀什小檗葉乙酸乙酯部位,使終濃度達(dá)0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次藥,記錄血管環(huán)張力的變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,2 組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(α=0.01)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血管環(huán)內(nèi)皮完整性檢查 Ach 可明顯舒張PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán),但是對(duì)PE 預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)幾乎沒有舒張作用,故本實(shí)驗(yàn)通過Ach(10 μmol/L) 對(duì)PE (1 μmol/L) 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)(或者去內(nèi)皮血管環(huán)) 的舒張率來判斷血管環(huán)的內(nèi)皮是否完整(或者去內(nèi)皮血管環(huán)是否建立成功)。若血管環(huán)舒張率達(dá)到75%以上判斷為內(nèi)皮完整的血管環(huán),可用于內(nèi)皮完整實(shí)驗(yàn)組；若血管環(huán)舒張率小于15%可認(rèn)為去內(nèi)皮血管,可用于去內(nèi)皮實(shí)驗(yàn)組。本實(shí)驗(yàn)中Ach 對(duì)PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)和去內(nèi)皮血管的舒張率分別為(91.25±3.12)%和(6.04±5.47)%,見圖1。

圖1 Ach 對(duì)PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)（A） 和去內(nèi)皮血管環(huán)（B） 的舒張作用Fig.1 Relaxation effectss of Ach on PE-pretreated endothelial-intact （A） and endothelial-free （B）aortic rings

3.2 喀什小檗葉不同萃取部位對(duì)PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)的舒張作用 喀什小檗葉石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位對(duì)PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)的最大舒張率Emax分別為(41.59±9.08)%、(94.66±5.19)%、(50.26±14.78)%、(42.35±7.73)%。與空白組比較,只有乙酸乙酯部位可濃度依賴性的舒張PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01),見圖2。

3.3 喀什小檗葉不同萃取部位對(duì)PE 預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用 喀什小檗葉石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位對(duì)PE 預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)的最大舒張率Emax分別為(41.31 ± 5.37)%、(92.49 ± 6.73)%、(39.26 ±10.78)%、(45.66±7.26)%。與空白組比較,只有乙酸乙酯部位可濃度依賴性舒張PE 預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見圖3?？κ残￠奕~乙酸乙酯部位對(duì)PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)和去內(nèi)皮血管環(huán)均有濃度依賴性舒張作用,Emax分別為(94.66±5.19)%、(92.49±6.73)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖4。

圖2 喀什小檗葉不同萃取部位對(duì)內(nèi)皮完整血管環(huán)的舒張作用Fig.2 Relaxation effectss of different extracts of B.kaschgarica leaves on endothelial-intact aortic rings

圖3 喀什小檗葉不同萃取部位對(duì)去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用Fig.3 Relaxation effects of different extracts of B.kaschgarica leaves on endothelial-free aortic rings

圖4 喀什小檗葉乙酸乙酯部位對(duì)內(nèi)皮完整血管環(huán)和去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用Fig.4 Relaxation effects of ethyl acetate extract of B.kaschgarica leaves on endothelial-intact and endothelial-free aortic rings

3.4L-NAME 對(duì)喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用的影響 喀什小檗葉乙酸乙酯部位對(duì)LNAME 組和乙酸乙酯部位組(與未經(jīng)L-NAME 預(yù)處理) 的血管環(huán)均具有濃度依賴性的舒張作用,Emax分別為(96.37±10.37)%、(94.66±5.19)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖5。

圖5 L-NAME 對(duì)喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用的影響Fig.5 Effects of L-NAME on vasorelaxation induced by ethyl acetate extract of B.kaschgarica leaves

4 討論

高血壓是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,也是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的主要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期血壓增高是導(dǎo)致中風(fēng)、冠心病以及腎衰的危險(xiǎn)因素之一［6］。目前已有不同種類的抗高血壓藥在臨床廣為應(yīng)用,但均有一定的毒副作用,故在天然植物中尋找具有舒張血管作用的高效、低毒活性組分仍有較大的意義和研究前景［7］。液-液萃取法是根據(jù)“相似相溶” 原理對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。由于萃取溶劑的極性不同,極性弱的成分分配到極性弱的溶劑中,極性強(qiáng)的成分分配到極性強(qiáng)的溶劑中。本實(shí)驗(yàn)中以喀什小檗葉為研究對(duì)象,利用液-液萃取法對(duì)喀什小檗葉醇提物進(jìn)行萃取,得到不同極性的采取部位(極性強(qiáng)弱順序?yàn)槭兔巡课唬家宜嵋阴ゲ课唬颊〈疾课唬妓课?,再利用離體血管實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同萃取部位進(jìn)行舒張血管活性篩選,結(jié)果表明喀什小檗葉乙酸乙酯部位具有顯著的舒張血管作用。

血管由單層的血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌組成［8］。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血液和血管平滑肌之間的機(jī)械屏障,在調(diào)節(jié)血管張力、血管生成、代謝、炎性細(xì)胞黏附、血小板凝聚、血管通透性等方面起著重要的作用,其功能損傷與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。舒張血管作用通過內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性等兩種途徑產(chǎn)生,內(nèi)皮依賴性舒張血管作用是通過促進(jìn)血管舒張因子的釋放和抑制血管收縮的釋放來產(chǎn)生,非內(nèi)皮依賴性舒張血管作用是通過阻滯鈣離子通道或者開放鉀離子通道來產(chǎn)生［11］。本實(shí)驗(yàn)中喀什小檗葉乙酸乙酯部位對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)均有濃度依賴性舒張血管作用,并且去內(nèi)皮處理后,其作用強(qiáng)度無明顯差異(P＞0.05),說明喀什小檗葉乙酸乙酯部位可能通過非內(nèi)皮途徑介導(dǎo)血管環(huán)的舒張作用。

NO 是以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶(eNOS) 的催化下生成的最重要的舒張血管因子。本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)皮完整離體血管環(huán)經(jīng)一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME) 預(yù)處理后,喀什小檗葉乙酸乙酯部位對(duì)內(nèi)皮完整血管環(huán)的舒張血管作用沒有受到抑制,說明喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用與內(nèi)皮源性NO 釋放無關(guān)。

血管平滑肌的收縮與舒張受多種離子的共同調(diào)節(jié),其中Ca2+濃度為至關(guān)重要,血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高導(dǎo)致血管平滑肌的收縮,細(xì)胞內(nèi)Ca2+來源于從細(xì)胞外的Ca2+通過鈣離子通道流入和細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣釋放［12］。血管平滑肌細(xì)胞存在電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channels,VDCCs) 和受體依賴性鈣通道 (receptor-operated calcium channels,ROCCs)［13］。PE 是α1-腎上腺素受體激動(dòng)劑,激活ROCCs,導(dǎo)致外鈣內(nèi)流,使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,最終導(dǎo)致血管收縮,另外PE與α1-腎上腺素受體結(jié)合后,通過G 蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C,從而產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3),IP3與肌質(zhì)網(wǎng)膜上IP3受體結(jié)合,引發(fā)肌漿網(wǎng)膜儲(chǔ)存Ca2+的釋放［14］。本實(shí)驗(yàn)中喀什小檗葉乙酸乙酯部位對(duì)PE 預(yù)收縮血管環(huán)具有濃度依賴性的舒張作用,表明其作用機(jī)制可能與影響鈣離子有關(guān),然而對(duì)于具體的作用機(jī)制,是抑制外鈣內(nèi)流還是抑制內(nèi)鈣釋放？ 本課題組還將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中給予進(jìn)一步深入研究。

小檗屬植物全世界分布廣泛,種類較多,喀什小檗為小檗科小檗屬落葉灌木［15-16］,近年來對(duì)喀什小檗的研究多為其常見藥用部位果實(shí)［17-19］,而非藥用部位(如葉) 往往被廢棄。因此,從喀什小檗葉中提取分離具有舒張血管作用的活性物質(zhì),不僅有利于探索具有心血管藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ),另外研究開發(fā)喀什小檗葉的藥用價(jià)值,使之變廢為寶,也有利于新疆地方特色植物資源的充分利用。