宿文杰，張玉堯，李榮森，王隸書，2，徐云鳳，張 鶴，4*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)/吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.長(zhǎng)春金賽藥業(yè)股份有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；4.長(zhǎng)春中醫(yī)院大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) FH.Chen 的干燥根,對(duì)血液系統(tǒng)有止血、抗血栓雙重作用。目前,三七中抗血栓類皂苷成分研究報(bào)道較多,其中原人參二醇型人參皂苷Rb1［1］、Rg3［2］、Rd 和Rh2［3］,原人參三醇型人參皂苷Re［4］、Rg1［5］、Rg2［6］,三七皂苷Fc［7］和R1［8］均可抑制血小板聚集和抗血栓形成。而三七中的止血成分主要是三七素［9-10］；三七皂苷Ft1 也有一定的止血功效［3,11］。在目前的研究中發(fā)現(xiàn),三七中三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.76%［12］,三七皂苷Ft1更低,故認(rèn)為三七中重要的止血成分仍未被發(fā)現(xiàn)。20 (S) -原人參二醇型皂苷在酸、堿、酶、微生物等條件下可水解脫去糖鏈,得到20 (S) -原人參二醇皂苷元 ［20 (S) -protopanaxadiol,PPD］［13-14］。近年來,研究發(fā)現(xiàn)PPD 能夠通過升高抑郁模型大鼠腦內(nèi)的去甲腎上腺素(NA)、HAV和5-羥色胺 (5-HT) 水平,發(fā)揮抗抑郁的作用［15］。而NA 和5-HT 水平升高可激活血小板,促進(jìn)血小板聚集［16-17］,Gao 等人報(bào)道PPD 能增加ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率［3］。目前尚未有PPD 在止血方面研究,因此本實(shí)驗(yàn)主要研究PPD 的止血作用并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性昆明小鼠(18～22 g) 和雄性Wistar 大鼠(180～200 g) 購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (吉) -2016-0003。實(shí)驗(yàn)經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)20170903),動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)飼養(yǎng)室內(nèi),12 h/12 h 晝夜循環(huán),室溫(22±2)℃,相對(duì)濕度50%～55%,自由攝食飲水,實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.1.2 試劑與儀器 20 (S) -原人參二醇(純度≥98%,批號(hào)MUST-16070401,上海源葉生物科技有限公司)；注射用白眉蛇毒血凝酶(Hemocoagulase,批號(hào)170622,錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司)；凝血酶原(PT,批號(hào)20181226)、活化部分凝血活酶時(shí)間 (APTT,批號(hào)20181226)、凝血酶時(shí)間(TT,批號(hào)20181226)、纖維蛋白原(FIB,批號(hào)20181226) 試劑盒(南京建成生物工程研究所)；螢光素/螢光素酶試劑和凝血酶(美國(guó)Chrono-Log公司)；Fluo 3-AM (批號(hào)S1056,碧云天生物技術(shù)研究所)；環(huán)磷酸腺苷 (cAMP) ELISA 試劑盒(批號(hào)20181009A)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP) ELISA試劑盒(批號(hào)20 181 009 A) (上海優(yōu)選生物科技有限公司)；PAC-1 (批號(hào)304904)、CD62P (批號(hào)362804) (美國(guó)BioLegend 公司)。自動(dòng)凝血分析儀(江蘇霍納醫(yī)療器械有限公司)；XT-2000i 自動(dòng)血液分析儀(日本希森美康株式會(huì)社)；700 型血小板聚集儀 (美國(guó)Chrono-log 公司)；Infinite M200Pro 多功能酶標(biāo)儀 (瑞士 Tecan 公司)；Cytation 5 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek 公司)；流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠斷尾和肝劃痕出血時(shí)間測(cè)定 小鼠斷尾模型,取雄性昆明小鼠(18～22 g) 40 只,隨機(jī)分為5 組,分別為空白對(duì)照組(1% CMC-Na 生理鹽水),血凝酶組 (1 kU/L),低、中、高劑量PPD 組(2、4、8 mg/kg)。皮下給藥4 h 后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。5 min 后,固定于鼠板,將鼠尾置于37 ℃生理鹽水中預(yù)溫3 min,距鼠尾尖端10 mm 處用干凈手術(shù)刀剪斷,尾巴浸沒37 ℃的生理鹽水中,記錄出血時(shí)間。出血時(shí)間是從剪斷開始出血到停止出血的時(shí)間。

小鼠肝劃痕模型,分組給藥方式與小鼠斷尾模型相同,麻醉5 min 后,固定于鼠板,用干凈的手術(shù)剪刀沿腹正中線剪開腹腔,暴露肝臟。保持小鼠生命,用2 mL 注射器形成約1 cm 創(chuàng)口,造成肝臟出血,用濾紙片每隔10 s 蘸一下,直至濾紙上沒有血跡為停止出血,記錄出血時(shí)間。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,二氧化碳安樂死法處死動(dòng)物。

1.2.2 大鼠血常規(guī)的檢測(cè) 將40 只Wistar 雄性大鼠(180～200 g) 隨機(jī)分為5 組,空白對(duì)照組(1% CMCNa 生理鹽水),血凝酶組(1 KU/mL),低、中、高劑量PPD 組(2、4、8 mg/kg)。皮下注射藥物4 h 后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,加入到含有EDTA 的抗凝管中。應(yīng)用XT-2000i 自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 凝血四項(xiàng)的測(cè)定 雄性Wistar 大鼠(180～200 g),腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,注入有3.8%枸櫞酸鈉的抗凝管中,顛倒混勻,3 000 r/min 離心15 min,上清為待測(cè)血漿。取1.45 mL 血漿,加入0.05 mL PPD,混合均勻后在37 ℃烘箱中孵育10 min,根據(jù)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化的部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT) 和纖維蛋白原濃度(FIB) 測(cè)定試劑盒說明書,應(yīng)用H1201 自動(dòng)凝血分析儀(江蘇霍納醫(yī)療器械有限公司,中國(guó)) 進(jìn)行檢測(cè)(具體步驟略)。血液標(biāo)本在4 h 內(nèi)完成測(cè)定。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠血小板cAMP 和cGMP 水平 參考文獻(xiàn)方法［18］,從雄性Wistar 大鼠腹主動(dòng)脈取血,3.8%枸櫞酸鈉(1 ∶9) 抗凝。800 r/min離心5 min,吸取上層富含血小板的血漿(PRP)。室溫下,2 500 r/min 離心8 min,棄去上清液,得到血小板團(tuán)塊。加入適量Tyrode’ s buffer (137 mmol/L NaCl,2 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,12 mmol/L NaHCO3,5 mmol/L HEPES,0.35% FBS,pH 7.4),反復(fù)洗滌2 次,重懸血小板。取145 μL 洗滌血小板與5 μL 不同濃度的PPD (終濃度為35、70、140 μmol/L),37 ℃恒溫孵育30 min,加150 μL 10 mmol/L EDTA 終止反應(yīng)。置于-80 ℃冰箱,反復(fù)凍融5 次,4 ℃4 000 r/min 離心10 min,收集上清液,按照大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP) 和大鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP) 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣品中cAMP 和cGMP 的水平。

1.2.5 洗滌血小板的制備 健康志愿者肘靜脈采血或雄性Wistar 大鼠(180～200 g) 腹主動(dòng)脈取血,3.8%枸櫞酸鈉(1 ∶9) 抗凝。800 r/min 離心5 min,吸取上層富血小板血漿 (platelet-rich plasma,PRP)；取PRP 血漿2 500 r/min 離心8 min,棄去上清液,得到濃縮血小板團(tuán)塊,加入適量Tyrode’s buffer,反復(fù)洗滌2 次,重懸血小板；用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀測(cè)定血小板數(shù)目,用Tyrode’s buffer調(diào)整洗滌人或大鼠血小板數(shù)目為3×108/mL。

1.2.6 ［Ca2+］i測(cè)定 取洗滌人血小板,加入Fluo-3AM (終濃度為5 μmol/L) 輕搖混勻后,避光放置37 ℃烘箱中孵育60 min,棄去熒光探針,用Tyrode’ s buffer 重懸血小板,調(diào)整血小板濃度為3×108/mL。取140 μL 負(fù)載Fluo-3 的血小板加入96 孔板(黑色,不透明),每孔加入藥物10 μL,溶劑作為空白對(duì)照,應(yīng)用Cytation 5 多功能酶標(biāo)儀每隔18 s 測(cè)定血小板胞漿內(nèi)［Ca2+］i,總檢測(cè)時(shí)間為20 min。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm,［Ca2+］i測(cè)定公式為:［Ca2+］i=Kd× (FFmin)/(Fmax-F),式中Kd是Ca2+結(jié)合Fluo 3-AM 的解離常數(shù),為525 nmol/L (37 ℃)［19］；F為各樣本熒光強(qiáng)度的測(cè)定值。Fmin和Fmax分別是最小熒光強(qiáng)度和最大熒光強(qiáng)度的測(cè)定值。Fmin和Fmax是分別在血小板中加入10 mmol/L EGTA 和0.1% Triton X-100 測(cè)定的熒光強(qiáng)度值。

1.2.7 血小板聚集率檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Chrono-log 700 血小板聚集儀采用比濁法測(cè)定血小板聚集率,轉(zhuǎn)速為1 000 r/min,溫度(37±1)℃。取洗滌大鼠/人血小板270 uL 加入反應(yīng)杯,放入血小板聚集儀,調(diào)整基線,分別加入30 μL 甲醇和PPD (終濃度為17.5、35、70、140、280 μmol/L),待血小板聚集到達(dá)最高聚集率后停止記錄。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次。

1.2.8 流式細(xì)胞分析儀測(cè)定CD62P (P-選擇素)的表達(dá)率和胱冬肽酶原激活物1 (procaspase activating compound 1,PAC-1) 結(jié)合率 取洗滌人血小板加入10 mmol/L CaCl2,使CaCl2終濃度為1 mmol/L。取含1 mmol/L CaCl2洗滌人血小板,加入不同濃度的PPD 放置37 ℃烘箱中孵育5 min,然后分別加入CD62P (FITC 標(biāo)記的P-選擇素) 和PAC-1 (FITC 標(biāo)記的PAC-1),室溫避光放置20 min,加入200 μL PBS 終止反應(yīng),使用流式細(xì)胞分析儀收集10 000 個(gè)血小板,分別計(jì)算CD62P的表達(dá)率和PAC-1 結(jié)合率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05 表示差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPD 對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響 從表1 可以看出,與空白對(duì)照組比較,3 個(gè)劑量組PPD 能縮短小鼠斷尾出血時(shí)間和小鼠肝劃傷出血時(shí)間,各給藥組均能降低小鼠斷尾出血時(shí)間(P＜0.05 或P＜0.01),同時(shí)PPD 減少了小鼠肝劃痕出血時(shí)間(P＜0.01)。

表1 PPD 對(duì)小鼠斷尾模型和肝劃痕模型出血時(shí)間的影響（， n=8）Tab.1 Effect of PPD on mouse bleeding time at tail amputation model and liver scratch model （， n=8）

表1 PPD 對(duì)小鼠斷尾模型和肝劃痕模型出血時(shí)間的影響（， n=8）Tab.1 Effect of PPD on mouse bleeding time at tail amputation model and liver scratch model （， n=8）

注:與空白對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 PPD 對(duì)大鼠血常規(guī)的影響 從表2～4 可以看出,與空白對(duì)照組比較,紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB) 和血小板(PLT) 參數(shù)均有明顯變化。紅細(xì)胞參數(shù)方面,與空白對(duì)照組比較,中劑量PPD 組增加大鼠RBC 數(shù)量(P＜0.01),見表2；低劑量PPD 組和中劑量PPD 組增加血漿中紅細(xì)胞壓積(HCT) (P＜0.05)。血紅蛋白參數(shù)方面,低劑量PPD 組中平均血紅蛋白量(MCH) 與空白對(duì)照組相比增高(P＜0.05),各給藥組大鼠HGB 數(shù)量及平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC) 略有升高,但無明顯差異(P＞0.05)。血小板參數(shù)方面,與空白對(duì)照組比較,中劑量PPD 組和高劑量PPD組能增加大鼠血清中血小板計(jì)數(shù)(PLT) 和血小板壓積(PCT) (P＜0.05,P＜0.01),見表4。與空白對(duì)照組比較,大鼠血清中其他血細(xì)胞參數(shù)(如白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等) 無明顯差異(P＞0.05)。

表2 PPD 對(duì)大鼠紅細(xì)胞參數(shù)的作用（， n=8）Tab.2 Effect of PPD on parameters of red blood cell in rats （， n=8）

表2 PPD 對(duì)大鼠紅細(xì)胞參數(shù)的作用（， n=8）Tab.2 Effect of PPD on parameters of red blood cell in rats （， n=8）

注:與空白對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

表3 PPD 對(duì)大鼠血紅蛋白參數(shù)的作用（， n=8）Tab.3 Effect of PPD on parameters of hemoglobin in rats （， n=8）

表3 PPD 對(duì)大鼠血紅蛋白參數(shù)的作用（， n=8）Tab.3 Effect of PPD on parameters of hemoglobin in rats （， n=8）

注:與空白對(duì)照組比較,*P＜0.05。

表4 PPD 對(duì)大鼠血小板參數(shù)的作用（， n=8）Tab.4 Effect of PPD on parameters of platelet in rats （， n=8）

表4 PPD 對(duì)大鼠血小板參數(shù)的作用（， n=8）Tab.4 Effect of PPD on parameters of platelet in rats （， n=8）

注:與空白對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.3 PPD 對(duì)大鼠凝血四項(xiàng)的影響 從表5 可以看出,PPD 各給藥組與空白對(duì)照組比較,PPD 3 個(gè)劑量組均能縮短大鼠APTT (P＜0.01 或P＜0.05),中劑量PPD 組、高劑量PPD 組增加纖維蛋白原水平(P＜0.05,P＜0.01),而對(duì)大鼠血漿TT 和PT沒有明顯差異(P＞0.05)。

表5 PPD 對(duì)大鼠凝血四項(xiàng)的作用（， n=3）Tab.5 Effect of PPD on plasmatic coagulation parameters of rats （， n=3）

表5 PPD 對(duì)大鼠凝血四項(xiàng)的作用（， n=3）Tab.5 Effect of PPD on plasmatic coagulation parameters of rats （， n=3）

注:與空白對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.4 PPD 對(duì)大鼠血漿cAMP 和cGMP 水平的影響 血小板內(nèi)cAMP 和cGMP 依賴蛋白激酶調(diào)節(jié)血小板的功能,在誘導(dǎo)和抑制血小板聚集過程中具有調(diào)節(jié)作用［20］。從表6 可以看出,與空白對(duì)照組比較,各給藥組能抑制大鼠cAMP 的產(chǎn)生(P＜0.01),呈劑量依賴性,當(dāng)PPD 濃度為140 μmol/L 時(shí),PPD對(duì)大鼠cAMP 的產(chǎn)生抑制作用最強(qiáng)；而對(duì)cGMP 的產(chǎn)生沒有影響(P＞0.05)。

表6 PPD 對(duì)大鼠血漿cAMP 和cGMP 水平的作用（，n=3）Tab.6 Effects of PPD on plasmatic cAMP and cGMP levels of rats （， n=3）

表6 PPD 對(duì)大鼠血漿cAMP 和cGMP 水平的作用（，n=3）Tab.6 Effects of PPD on plasmatic cAMP and cGMP levels of rats （， n=3）

注:與空白對(duì)照組比較,**P＜0.01。

2.5 PPD 促進(jìn)血小板Ca2+內(nèi)流 血小板胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度的升高在血小板活化中起到重要作用［21］,因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)PPD 對(duì)血小板鈣離子內(nèi)流的作用。圖1A 顯示,隨著PPD 對(duì)洗滌人血小板作用時(shí)間增加,血小板內(nèi)［Ca2+］i增加,而凝血酶的作用比較強(qiáng),加入瞬間就可以增加血小板內(nèi)［Ca2+］i。圖1B 顯示,與溶劑對(duì)照組比較,140 μmol/L PPD 在5 min 時(shí)增加［Ca2+］i(P＜0.05),隨著作用時(shí)間增加,70、35 μmol/L PPD 分別在10、15 min 增加［Ca2+］i(P＜0.05)。

2.6 PPD 對(duì)洗滌大鼠/人血小板聚集的影響 血小板聚集是指血小板之間相互黏著、聚集成團(tuán)的現(xiàn)象,是血小板的主要功能之一,在生理性止血和病理性血栓形成中均占重要地位［22］。從表7 可以看出,與空白對(duì)照組比較,PPD 可增加洗滌大鼠/人血小板聚集并呈劑量依賴性,濃度大于35 μmol/L可增加大鼠血小板的聚集率；在濃度大于140 μmol/L時(shí),PPD 對(duì)洗滌大鼠/人血小板的聚集率增加趨勢(shì)均不明顯；當(dāng)濃度為140 μmol/L 時(shí),大鼠血小板聚集度為40.43%,人血小板聚集度為28.25%。

圖1 PPD 對(duì)血小板內(nèi)［Ca2+］i 濃度的作用Fig.1 Effect of PPD on the ［Ca2+］i of platelets

表7 PPD 對(duì)洗滌血小板的聚集作用（， n=3）Tab.7 Aggregation effect of PPD on washing platelets （， n=3）

表7 PPD 對(duì)洗滌血小板的聚集作用（， n=3）Tab.7 Aggregation effect of PPD on washing platelets （， n=3）

注:與空白對(duì)照組比較,**P＜0.01。

2.7 PPD 促進(jìn)CD62P 表達(dá) CD62P 存在于靜息血小板的α 顆粒中；血小板活化時(shí)釋放CD62P,參與血小板黏附、聚集等一系列反應(yīng)。CD62P 是血小板活化的主要指標(biāo)［23］。從圖2B 可以看出,隨著PPD 濃度增加,血小板CD62P 表達(dá)率增加；與空白組比較,PPD 濃度大于17.5 μmol/L 時(shí)能增加血小板CD62P 表達(dá)率(P＜0.01)；當(dāng)PPD 濃度達(dá)到140 μmol/L 時(shí),血小板 CD62P 表達(dá)率為81.90%,表達(dá)率與凝血酶作用相當(dāng)。但圖2A 顯示,140 μmol/L PPD 作用明顯弱于凝血酶。

圖2 PPD 對(duì)血小板α 顆粒物質(zhì)釋放的作用Fig.2 Effect of PPD on α granule release of platelets

2.8 PPD 增加血小板PAC-1 的結(jié)合率 PAC-1 是血小板膜糖蛋白(GP) IIb/IIIa 復(fù)合物,血小板活化后構(gòu)型會(huì)發(fā)生改變,PAC-1 是評(píng)價(jià)血小板活化的重要指標(biāo)［24］。從圖3 可以看出,隨著PPD 濃度增加,血小板PAC-1 的結(jié)合率增加。與溶劑對(duì)照組比較,PPD 濃度大于17.5 μmol/L 時(shí)能增加血小板PAC-1 結(jié)合率；當(dāng)PPD 濃度達(dá)到140 μmol/L 時(shí),血小板PAC-1 結(jié)合率為90.40%,其作用與凝血酶的作用相當(dāng)。

圖3 PPD 對(duì)血小板PAC-1 結(jié)合率的作用Fig.3 Effect of PPD on PAC-1 binding rate of platelets

3 討論

三七中原人參二醇型皂苷約占總皂苷的60%以上［25］,其在體內(nèi)經(jīng)在酸、堿等條件下可水解脫去糖鏈,得到 20 (S) -原人參二醇皂苷元(PPD)［13-14］,是重要的活性成分。本研究通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原人參二醇具有止血作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

小鼠斷尾和肝臟劃痕模型是篩選止血藥物常用的模型［26-27］,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPD 能抑制小鼠出血時(shí)間。通過檢測(cè)大鼠的血常規(guī),發(fā)現(xiàn)原人參二醇可提高PLT、PCT、紅細(xì)胞參數(shù)中的RBC 和HCT,RBC 是止血過程中的重要參與者［28］,而PCT 和HCT 升高與靜脈血栓形成密切相關(guān)［29-30］。因此,以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPD 通過增加PLT 和RBC數(shù)量,影響PCT 和HCT,參與止血過程。

凝血四項(xiàng)是研究藥物參與內(nèi)源性和外源性凝血途徑的檢測(cè)方法［31］。PT 和APPT 分別是外源性和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)常用的篩選實(shí)驗(yàn)；TT 反映凝血共同途徑纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的所需時(shí)間；FIB 在凝血酶水解下最后形成不溶性的纖維蛋白,進(jìn)而止血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PPD 可縮短APTT,增加FIB 的水平,表明PPD 可激活內(nèi)源性凝血途徑,促進(jìn)FIB 生成,從而發(fā)揮止血作用。

cAMP 和cGMP 是調(diào)節(jié)血小板功能的抑制性細(xì)胞內(nèi)第二信使,可誘導(dǎo)血小板聚集［32-33］。cAMP 水平與［Ca2+］i呈負(fù)相關(guān)［34］,鈣離子廣泛參與血小板的活化過程,Ca2+的升高可改變血小板的形態(tài),顆粒釋放和GP-IIb/IIIa 活化［21］。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PPD 能抑制血小板內(nèi)cAMP 釋放,促進(jìn)血小板Ca2+內(nèi)流；同時(shí)可直接誘導(dǎo)洗滌大鼠/人血小板聚集。以上結(jié)果表明PPD 通過抑制cAMP 釋放,升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平,激活血小板,觸發(fā)血小板的變形,并誘導(dǎo)血小板聚集而達(dá)到止血的作用。

CD62P 是細(xì)胞黏附分子選擇素家族成員之一。血小板活化時(shí)CD62P 從α 顆粒中釋放與血小板表面的胞膜融合,參與血小板黏附、聚集等一系列反應(yīng)。PAC-1 是活化血小板上的GP Ⅱb/Ⅲa 復(fù)合物［24］。當(dāng)血小板受到刺激時(shí),血小板由膜內(nèi)向膜外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起血小板空間構(gòu)型改變,形成活化的GPⅡb/Ⅲa 復(fù)合物,促進(jìn)其與纖維蛋白原結(jié)合,引起纖維蛋白原構(gòu)型改變［35］。CD62P 和PAC-1 是早期血小板活化最特異性的標(biāo)志物［36］。結(jié)果顯示PPD 能增加CD62P 釋放和PAC-1 表達(dá)率,表明PPD 通過促進(jìn)顆粒物質(zhì)的釋放、膜蛋白與血小板表面黏附以及GPⅡb/Ⅲa 復(fù)合物與纖維蛋白原結(jié)合,促進(jìn)血小板聚集。

綜上所述,PPD 可能是一方面通過激活大鼠的內(nèi)源性凝血系統(tǒng),影響體內(nèi)血小板和紅細(xì)胞參數(shù),促進(jìn)血漿中纖維蛋白原生成；另一方面通過影響鈣離子和cAMP 信號(hào)通路,增加血小板Ca2+內(nèi)流、CD62P 釋放和促進(jìn)PAC-1 的表達(dá),誘導(dǎo)血小板聚集,達(dá)到止血的作用。本研究對(duì)PPD 的止血作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討,為三七藥物的功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。