陳 影，吳 婷，姜 超，襲曉昀，張 倩，戴國(guó)梁，許美娟，居文政

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖,能活血祛瘀,主要用于治療胸痹心痛,其有效成分有水溶性、脂溶性兩類,前者主要包括丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸D 等。研究表明,丹參酚酸具有改善微循環(huán)［1］、抑制血小板聚集［2］、抗氧化［3］、增加冠脈流量［4］和心肌供氧量［5］等藥理作用。

由于丹參水溶性成分的活血祛瘀功效良好,而且注射液起效迅速,療效顯著,故市場(chǎng)上出現(xiàn)多種含丹參水提物的中藥注射液,但2020 年版《中國(guó)藥典》 僅以丹酚酸B、迷迭香酸為其水溶性成分檢測(cè)指標(biāo),難以保障丹參內(nèi)在質(zhì)量,具有一定的局限性；多指標(biāo)質(zhì)量控制模式需要較多種類的標(biāo)準(zhǔn)品,而且有一部分價(jià)格昂貴,穩(wěn)定性差。

王智民［6］等提出利用一種相對(duì)易得、廉價(jià)的內(nèi)參來(lái)實(shí)現(xiàn)多種成分同時(shí)測(cè)定的一測(cè)多評(píng)法,被認(rèn)為適合于中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)模式,已廣泛應(yīng)用于中藥材［7-8］及中藥制劑［9-10］的研究。目前,已有文獻(xiàn)報(bào)道指紋圖譜、一測(cè)多評(píng)等方法在含丹參制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用［11-12］,但尚未涉及丹酚酸E、丹酚酸D。因此,本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定丹參注射液、丹紅注射液、冠心寧注射液、香丹注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 的含量,以期為上述中藥注射液的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Waters e2695 型高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters 公司)；Milli-Q Advantage A10 型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司)；KH5200E 型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；CPA225D 型電子天平(德國(guó)Sartorius 公司)。

丹參素鈉(批號(hào)180302-014)、紫草酸(批號(hào)180724-028)、原兒茶醛(批號(hào)13021902) 對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹酚酸E (批號(hào)DST190507-065) 對(duì)照品購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司；丹酚酸D (批號(hào)12122305)、迷迭香酸(批號(hào)16040512)、丹酚酸B (批號(hào)13020104)、丹酚酸A (批號(hào)13020701) 對(duì)照品均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司,純度均大于98%。丹參注射液購(gòu)自正大青春寶藥業(yè)有限公司(批號(hào)1901183、1811203、1711052)；丹紅注射液購(gòu)自山東丹紅制藥有限公司(批號(hào)19031017、17091018)；冠心寧注射液購(gòu)自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司 (批號(hào)181101)；香丹注射液購(gòu)自國(guó)藥宜賓制藥有限公司(批號(hào)18100412)；維生素C 注射液購(gòu)自華潤(rùn)雙鶴利民有限公司(批號(hào)19040213)。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～8 min,5%～13%A；8～14 min,13%～15% A；14～17 min,15%～23%A；17～22 min,23%～25% A；22～27 min,25%～27% A；27～30 min,27%～35% A；30～34 min,35%～5%A；34～38 min,5%A)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 對(duì)照品適量,50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為3.97、3.50、1.00、3.82、1.32、5.02、3.53、3.44、1.00 mg/mL,即得。

2.2.2 供試品溶液 取丹參注射液、丹紅注射液、冠心寧注射液、香丹注射液適量,50% 甲醇稀釋10 倍,并加入適量維生素C 注射液,12 000 r/min離心10 min,取上清,即得(含0.1%維生素C)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)及峰純度檢測(cè) 取對(duì)照品、供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖1。由此可知,各成分基本達(dá)到基線分離,分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)以各成分計(jì),均不低于5 000。同時(shí),采用光電二極管陣列檢測(cè)器對(duì)各成分進(jìn)行紫外光譜掃描和峰純度檢測(cè),發(fā)現(xiàn)除咖啡酸、丹酚酸E 含量低于定量下限外,其余成分紫外吸收光譜與相應(yīng)對(duì)照品基本一致；除丹紅注射液、香丹注射液中咖啡酸因含量過(guò)低,峰純度因子低于900 外,其余成分均大于980。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,制成6 個(gè)質(zhì)量濃度,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,并分別以S/N=3、S/N=10 為檢測(cè)限、定量限,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 峰面積RSD 分別為0.90%、0.83%、0.86%、0.65%、0.73%、0.81%、0.88%、0.67%、0.82%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取丹參注射液 (批號(hào)1901183)、丹紅注射液(批號(hào)19031017)、冠心寧注射液 (批號(hào)181101)、香丹注射液 (批號(hào)18100412),按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各成分峰面積RSD 均≤2.15%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丹參注射液 (批號(hào)1901183)、丹紅注射液(批號(hào)19031017)、冠心寧注射液 (批號(hào)181101)、香丹注射液 (批號(hào)18100412),按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于 0、6、12、18、24、30、36、48 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得各成分峰面積RSD 均分別小于等于2.59%、2.34%、3.18%、2.71%、2.19%、2.51%、2.15%、2.95%、2.11%,表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的丹參注射液 (批號(hào)1901183)、丹紅注射液(批號(hào)19031017)、冠心寧注射液(批號(hào)181101)、香丹注射液(批號(hào)18100412),精密加入適量對(duì)照品溶液,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法各平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,丹參素平均加樣回收率95.63%～101.62%,RSD≤2.92%；原兒茶醛平均加樣回收率94.48%～106.08%,RSD ≤3.42%；咖啡酸(僅在丹參注射液、冠心寧注射液中) 平均加樣回收率100.13%～109.07%,RSD≤5.61%；丹酚酸D平均加樣回收率96.60%～101.82%,RSD≤2.93%；迷迭香酸平均加樣回收率96.17%～102.29%,RSD≤2.66%；紫草酸平均加樣回收率99.51%～102.57%,RSD≤4.89%；丹酚酸B 平均加樣回收率95.21%～103.81%,RSD≤2.96%；丹酚酸E (僅在丹參注射液、香丹注射液中) 平均加樣回收率90.37%～102.23%,RSD≤4.10%；丹酚酸A 平均加樣回收率95.09%～102.41%,RSD≤5.16%。

2.4 相對(duì)校正因子測(cè)定 吸取“2.3.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以原兒茶醛為內(nèi)標(biāo),分別采用斜率法、多點(diǎn)校正法計(jì)算其他8 種成分相對(duì)校正因子fk/s,公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/ (CsAk),其中Ck為其他成分含量,Ak為其他成分峰面積,Cs為內(nèi)標(biāo)含量,As為內(nèi)標(biāo)峰面積,結(jié)果見表2,可知2 種方法所得結(jié)果接近［相對(duì)誤差(RE) ≤1.72%］。

2.5 耐用性考察

2.5.1 儀器、色譜柱 本實(shí)驗(yàn)考察了Waters 2695、Agilent 1100 色譜儀,以及Agilent ZORBAX SB-C18、Waters Symmetry C18、Thermo Syncronis C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) 對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見表3,可知均無(wú)明顯影響(RSD≤4.75%)。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 進(jìn)樣體積、體積流量、柱溫 本實(shí)驗(yàn)采用Waters 2695 色譜儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱,考察進(jìn)樣體積5、10、20 μL,體積流量0.8、1.0 mL/min,柱溫25、30、35 ℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見表4,可知均無(wú)明顯影響(RSD≤1.40%)。

表4 不同進(jìn)樣體積、體積流量、柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different injection volumes，volumetric flow rates and column temperatures on relative correction factors

2.6 色譜峰定位 吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,考察“2.5.1” 項(xiàng)下色譜儀、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響,結(jié)果見表5,可知均無(wú)明顯影響(RSD≤3.17%)。

表5 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.7 樣品含量測(cè)定 取3 批丹參注射液、2 批丹紅注射液、1 批冠心寧注射液、1 批香丹注射液,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量,結(jié)果見表6,可知2 種方法所得結(jié)果接近(RE≤4.78%)。

表6 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.6 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)中有機(jī)相考察了乙腈、甲醇及其混合液,水相考察了甲酸、磷酸,發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸洗脫時(shí)各成分色譜峰峰形良好,出峰時(shí)間早,基線平穩(wěn),故選擇其作為流動(dòng)相。前期關(guān)于丹酚酸類成分一測(cè)多評(píng)的文獻(xiàn)中,柱長(zhǎng)大多為250 mm［13］。又因在本方法下,待測(cè)色譜峰分離度良好,用時(shí)較短,故選擇柱長(zhǎng)為150 mm,可為丹參制劑的質(zhì)量控制提供更多參考。

3.2 抗氧化劑選擇 梁文儀［14］等報(bào)道,丹酚酸A在抗氧化、抗心肌缺血/再灌注方面均有明顯藥理活性,但該成分不穩(wěn)定［15］,許多研究也不測(cè)定它在丹參制劑中的含量［16］。為更好地體現(xiàn)含丹參成分中藥注射液的內(nèi)在質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)擬添加抗氧化劑以增強(qiáng)丹酚酸A 穩(wěn)定性,參考文獻(xiàn)［17-18］ 確定為維生素C,并考察了含0～0.5%該成分的丹參注射液在48 h 內(nèi)的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)其含量在不加維生素C 時(shí)于6 h 內(nèi)減少了79%,而加入0.1%維生素C 后于48 h 內(nèi)僅降低3.2%。

3.3 內(nèi)標(biāo)選擇 由于原兒茶醛穩(wěn)定性好,響應(yīng)值高,而且價(jià)廉易得,故選擇其作為內(nèi)標(biāo)［19］。另外,不同高效液相色譜儀對(duì)丹參素的響應(yīng)差別較其他成分大［20］,應(yīng)予以關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法可同時(shí)測(cè)定丹參注射液、丹紅注射液、冠心寧注射液、香丹注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 的含量,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。同時(shí),該方法也可應(yīng)用于丹參水溶性成分的質(zhì)量控制,從而為全面評(píng)價(jià)該系列制劑的質(zhì)量提供參考。