連曉峰,韓鵬,李永鋒,許志強(qiáng),王東傲

1濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(河南安陽(yáng) 455000); 2河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科(河南鄭州 450003)

支氣管哮喘是指患者哮喘疾病急性發(fā)作，經(jīng)過(guò)常規(guī)治療后效果不明顯或者出現(xiàn)爆發(fā)性發(fā)作，在很短時(shí)間內(nèi)病情發(fā)展至危重狀態(tài)[1]。支氣管哮喘是臨床中十分常見(jiàn)的一種危急慢性呼吸系統(tǒng)疾病，主要特點(diǎn)是治療困難、哮喘持續(xù)時(shí)間超過(guò)1 d、發(fā)病急、癥狀嚴(yán)重、發(fā)病率高等，如果得不到及時(shí)治療，極易出現(xiàn)呼吸衰竭、呼吸道阻塞等狀況，嚴(yán)重時(shí)危及患者生命[2-3]。哮喘疾病預(yù)后與患者病程時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)，而與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。其發(fā)作機(jī)制主要為炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)，能夠引起患者微血管滲漏、氣道痙攣、氣道高反應(yīng)、分泌物增多、氣道上皮細(xì)胞損傷等，此外還有遺傳環(huán)境因素、神經(jīng)機(jī)制等[4]。正常情況下，人體免疫細(xì)胞及各淋巴細(xì)胞亞群均處于一種平衡狀態(tài)，當(dāng)人體受到各種因素影響免疫狀態(tài)失衡，則會(huì)產(chǎn)生腫瘤、炎癥反應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病[5]。所以本次采取控制單一變量方法探討細(xì)胞免疫應(yīng)答變化與支氣管哮喘疾病進(jìn)展的相關(guān)性，為提高支氣管哮喘治療提供新的依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2018年5月安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院接診治療的95例支氣管哮喘患者為觀察組，選取同期在安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院體檢的健康人95例為對(duì)照組，本研究經(jīng)安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審理批準(zhǔn)。兩組對(duì)象臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象資料對(duì)比分析

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：支氣管哮喘患者[6]；未進(jìn)行其他治療；無(wú)精神??；未患有影響本次研究的臟器衰竭等疾?。煌鈪⒓颖敬窝芯?。排除標(biāo)準(zhǔn)：中途退出研究者；診斷、治療等病歷資料不全者；過(guò)敏者；無(wú)法參與研究者；全身免疫系統(tǒng)疾病者。

1.3 研究方法 抽取兩組研究對(duì)象空腹靜脈血8 mL，使用上海知閔儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的離心機(jī)離心，離心半徑設(shè)置為15 cm，轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 000 r/min，分離血清，按照文獻(xiàn)[7]的方法分離單個(gè)核細(xì)胞。按照文獻(xiàn)[8]方法將處理過(guò)的單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)記輔助性T細(xì)胞1 (T helper cells 1，Th1)、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell，Treg)。然后將所有試管孵育20 min，避光，然后使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，重懸后使用東芝醫(yī)療系統(tǒng)(中國(guó))有限公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀測(cè)定上述細(xì)胞比例。采用定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)法檢測(cè)研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況：每孔細(xì)胞中加入浙江康德藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的TRIZOL裂解液，然后放置于冰上5 min，即可提取總RNA。提取總RNA 5 μg，在65℃條件下冰浴3 min，變性10 min，使用美嵐實(shí)業(yè)(上海)有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，-20℃保存。使用常州德燁化工有限公司生產(chǎn)的生物染料法熒光定量試劑盒以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，參照GAPDH，在94℃條件下預(yù)變性2 min，94℃條件下變性30 s，60℃條件下變性30 s，72℃條件下變性30 s，循環(huán)35個(gè)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-4、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-10、IL-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-22 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定研究對(duì)象IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17、TGF-β、IL-22蛋白表達(dá)水平，使用東芝醫(yī)療系統(tǒng)(中國(guó))有限公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀測(cè)定研究對(duì)象血液中CD3+、CD4+、CD8+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+，所使用試劑盒均購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)、比率表示，采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例結(jié)果分析 觀察組Treg和Th1細(xì)胞占比低于對(duì)照組，Th2和Th17細(xì)胞占比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，觀察組Th1/Th2低于對(duì)照組，Th17/Treg高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 兩組對(duì)象免疫功能變化分析 觀察組CD4+/CD8+、CD8+、CD3+和CD4+水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 研究對(duì)象細(xì)胞因子mRNA表達(dá)結(jié)果分析 觀察組TGF-β、IL-2和IFN-γ mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，IL-22、IL-17、IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖1。

表2 研究對(duì)象輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例結(jié)果分析

表3 兩組對(duì)象免疫功能變化分析

表4 兩組對(duì)象細(xì)胞因子mRNA表達(dá)結(jié)果分析

圖1 研究對(duì)象細(xì)胞因子生物染料法熒光定量引物特異性檢測(cè)圖

2.4 研究對(duì)象細(xì)胞因子蛋白表達(dá)結(jié)果分析 觀察組TGF-β、IL-2和IFN-γ 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，IL-22、IL-17、IL-4和IL-10 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

3 討論

Th細(xì)胞、Treg 在人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要作用[9-10]。Th1細(xì)胞能夠分泌腫瘤壞死因子、IL-2、IFN-γ 等，能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生等[11]。Th2細(xì)胞能夠分泌IL-5、IL-10和IL-4等，主要作用于體液免疫，在人體B細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-13]。正常情況下，人體Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，互相制約、但是一旦動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，機(jī)體正常的免疫功能將受到破壞[14-15]。Th17細(xì)胞能夠分泌IL-21、IL-22和IL-17等，能夠調(diào)節(jié)人體自身的免疫應(yīng)答以及部分抗感染免疫反應(yīng)[16]。Treg細(xì)胞能夠分泌IL-10、TGF-β等，在腫瘤免疫、自身免疫方面具有重要作用。Th17/Treg失去平衡將造成人體自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病的發(fā)生[17]。Th細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞主要亞群之一，可調(diào)控、協(xié)助體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，在慢性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，T細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子在Th17/Treg和Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。支氣管哮喘是由多種炎癥因子參與的嚴(yán)重性氣道炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子主要由人體免疫細(xì)胞分泌，能夠在人體細(xì)胞間傳遞信息，主要功能是效應(yīng)功能和免疫調(diào)節(jié)，其在提高人體免疫力、維持機(jī)體生理平衡、預(yù)防腫瘤、抵抗外援病原體侵襲等具有重要作用，一旦細(xì)胞因子表達(dá)異常則會(huì)引發(fā)人體腫瘤、休克、發(fā)熱等癥狀。Th2細(xì)胞免疫過(guò)度反應(yīng)造成Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的免疫學(xué)基礎(chǔ)。人體存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)維持免疫系統(tǒng)Th1、Th2的平衡，IFN-γ可負(fù)向調(diào)節(jié)Th2的平衡，IL-4可負(fù)向調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞。

表5 研究對(duì)象細(xì)胞因子蛋白表達(dá)結(jié)果分析

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一種促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的活性蛋白，可參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生存、分化及凋亡，并與多種炎性反應(yīng)有關(guān)，神經(jīng)激肽A是分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，可促進(jìn)氣管平滑肌的收縮，調(diào)控炎性因子釋放，本次研究發(fā)現(xiàn)，觀察組Treg和Th1細(xì)胞占比低于對(duì)照組，觀察組Th1/Th2低于對(duì)照組，IL-4和IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，這說(shuō)明支氣管哮喘患者體內(nèi)Th1/Th2失衡，可能是Th1向Th2發(fā)生部分轉(zhuǎn)化造成的。部分研究提出，IL-4在哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用，IFN-γ 則是一種十分有效的抗喘因子，同時(shí)IFN-γ和IL-4能夠有效維持Th1/Th2的平衡。IL-4和IFN-γ又會(huì)促進(jìn)Th1的分化，IL-4可以拮抗IFN-γ，能夠調(diào)節(jié)Th2的分化，這些細(xì)胞因子的變化又加劇了Th1/Th2的失衡，這和部分研究人員研究結(jié)果基本一致[19-20]。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，觀察組Th17/Treg高于對(duì)照組，TGF-β表達(dá)水平下降，IL-22、IL-17表達(dá)上升，這說(shuō)明患者體內(nèi)Th17/Treg失衡。Th17分泌的促炎因子可引發(fā)人體內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)Th17分化，抑制Treg細(xì)胞，同時(shí)抑制炎癥因子IL-10和TGF-β水平下降，致使人體免疫能力下降。人體內(nèi)成熟的T細(xì)胞主要有CD3+、CD4+、CD8+等，CD3代表總T細(xì)胞，CD4代表T輔助細(xì)胞，CD8代表T細(xì)胞毒性細(xì)胞。本次研究發(fā)現(xiàn)，觀察組CD4+/CD8+、CD8+、CD3+和CD4+水平均低于對(duì)照組，這表明患者免疫能力與健康人群比較明顯下降，這與部分人員的研究結(jié)果基本一致[21-22]。

綜上所述，支氣管哮喘患者CD4+/CD8+、Th17/Treg和Th1/Th2比值較健康人群發(fā)生變化，支氣管哮喘疾病的進(jìn)展可能與這些細(xì)胞免疫應(yīng)答的異常變化密切相關(guān)。但是本次研究對(duì)象均從安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院抽取且均集中在較短時(shí)間段內(nèi)，研究結(jié)果有局限性，尚需進(jìn)一步研究。