周光華，謝瓊珺，羅 平

（1.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院眼科，廣東 廣州 510900；2.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

血管瘤是目前臨床上常見的嬰幼兒腫瘤，其新生兒患病率為1.1%～2.6%［1］，嚴(yán)重者可損毀容貌。目前臨床上主要采用藥物、導(dǎo)管介入、硬化劑局部注射、激光及手術(shù)治療等［2］，雖取得一定的治療效果，但均存在不同程度的不良反應(yīng)。因此，尋求新的高效低毒的方法是目前研究的熱點(diǎn)。近些年，醫(yī)學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥對其有一定的治療作用［3］。油茶是一種高營養(yǎng)且無毒的保健食用油［4］。油茶皂苷是其生物活性提取物，具有抗炎、抗高血脂血癥、抗?jié)B出及抗腫瘤等作用［5］。本研究通過不同濃度油茶皂苷作用于血管瘤EOMA 細(xì)胞，探討其藥理作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑油茶皂苷來自贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李洪亮課題組，小鼠血管瘤EOMA 細(xì)胞由贛南醫(yī)學(xué)院劉潛教授惠贈，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司，CCK8 檢測試劑盒、吖啶橙（AO）染色劑及細(xì)胞周期檢測試劑盒購自于南京凱基生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器液相色譜/質(zhì)譜儀（美國沃特斯xe?vog2-xstof）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）、全自動酶標(biāo)儀（Bio-Rad 公司）、低溫高速離心機(jī)（德國Eppdorff 公司）、流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD 公司）、倒置顯微鏡和熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油茶皂苷的提取油茶粕經(jīng)過粉碎機(jī)制成細(xì)粉，過40 目篩，稱取100 g 油茶粕細(xì)粉經(jīng)石油醚60 ℃回流4 h，脫脂后烘干，用65%乙醇回流提取2 h，提取溫度60 ℃，料液比1∶20，濃縮，石油醚，乙酸乙酯洗滌3 次，正丁醇萃取，活性炭脫色，濃縮。樣品用洗脫劑溶解，過濾除去不溶性雜質(zhì)，上樣，用甲醇水系統(tǒng)洗脫，濃縮得精制油茶皂苷，液相色譜/質(zhì)譜儀進(jìn)樣檢測，油茶皂苷純度為85%。

1.3.2 血管瘤EOMA 細(xì)胞復(fù)蘇接種將EOMA 細(xì)胞從液氮中取出，快速放入37 ℃水浴鍋中，用含10%FBS 的完全培養(yǎng)基重懸混勻后放入37 ℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按1∶3的比例傳代，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的EOMA 細(xì)胞，使用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到2.5×105個(gè)/mL。

1.3.3 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖接種對數(shù)生長期的EOMA 細(xì)胞（2.5×105個(gè)/mL）于96 孔板，貼壁生長24 h 后，加入不同濃度油茶皂苷（10、20、40、80、160 mg·L-1）作用24 h，加入CCK8 后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，震蕩充分溶解，A450 nm檢測OD值。

1.3.4 吖啶橙（AO）染色法熒光顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)接種對數(shù)生長期的EOMA 細(xì)胞于6 孔板，貼壁生長24 h 后，依據(jù)CCK8 試驗(yàn)結(jié)果將試驗(yàn)分為3 組：EOMA 細(xì)胞空白組；20 mg·L-1油茶皂苷處理組；40 mg·L-1油茶皂苷處理組，油茶皂苷作用24 h后消化收集細(xì)胞，重復(fù)洗滌2 次，重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液106個(gè)/mL，取95 μL 細(xì)胞懸液加5 μL AO 染液混合后，避光作用10 min，吸5 μL 于載玻片上并用蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察200 個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（VN）、凋亡細(xì)胞（VA）及壞死細(xì)胞（NVN），每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3 次。凋亡比例=［VA／（VN+VA+NVN）］×100%。

1.3.5 油茶皂苷對血管瘤EOMA 細(xì)胞的周期影響按1.3.4 方法處理后消化收集洗滌細(xì)胞，用100 μL PBS 重懸細(xì)胞，緩慢加入700 μL 預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%；4 ℃固定4 h 以上，1 000 rpm 離心5 min，吸棄固定液，預(yù)冷PBS 潤洗2次，加入100 μL RNase（50 μg·mL-1），37 ℃水浴30 min；加入400 μL PI（50 μg·mL-1），4 ℃避光染色30 min；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，分析各細(xì)胞周期的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 對本研究中所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 油茶皂苷對血管瘤EOMA 細(xì)胞的增殖影響油茶皂苷作用EOMA 細(xì)胞24 h 后，隨著油茶皂苷的濃度增加其對EOMA 細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴性，與EOMA 細(xì)胞對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.18，P＜0.05）（圖1）。

2.2 油茶皂苷誘導(dǎo)血管瘤EOMA 細(xì)胞凋亡油茶皂苷作用EOMA 細(xì)胞24 h 后，熒光顯微鏡下可見EOMA細(xì)胞數(shù)量明顯減少，濃縮的綠色熒光，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮（圖2）。

圖1 油茶皂苷對血管瘤EOMA細(xì)胞的增殖影響

圖2 EOMA細(xì)胞形態(tài)變化（AO×200）

AO 染色可根據(jù)細(xì)胞著色及染色質(zhì)的形態(tài)區(qū)分出活細(xì)胞（VN）、凋亡細(xì)胞（VA）和壞死細(xì)胞（NVN），油茶皂苷20 mg·L-1組、40 mg·L-1組凋亡率分別為9.5%、14.0%，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（卡方值為6.105，P＜0.05）（表1）。

表l 不同濃度油茶皂苷對血管瘤EOMA細(xì)胞的凋亡影響

2.3 油茶皂苷對血管瘤EOMA 細(xì)胞的周期影響與對照組相比，油茶皂苷20 mg·L-1組、40 mg·L-1組細(xì)胞G0/G1 期比例顯著增加而S 期比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 油茶皂苷對血管瘤EOMA細(xì)胞的周期影響

3 討 論

油茶是分布于我國長江流域及其以南地區(qū)的一種食用保健油［6］。油茶皂苷是油茶種子經(jīng)榨油后的殘?jiān)刑崛〕鰜淼幕钚晕铩瀛h(huán)三萜類皂苷，具有抗腫瘤的藥理學(xué)作用［5，7］。研究顯示，油茶皂苷可通過提高免疫功能抑制肝癌和肺癌細(xì)胞的增殖［8］。體外實(shí)驗(yàn)顯示油茶皂苷能顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，其可能機(jī)制是激活Caspase信號通路，誘發(fā)PARP 底物的斷裂，進(jìn)一步上調(diào)IRE1 蛋白的表達(dá)水平及活化Perk、eIF2a 和eEF2 蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡［9］。MA LY等發(fā)現(xiàn)油茶皂苷可抑制Jurkat 細(xì)胞增殖，阻滯G0/G1 期，其可能的機(jī)制是下調(diào)p-Bcl-2 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)caspase-3、PARP 和Caspase-9 蛋白的表達(dá)水平［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)：油茶皂苷能降低MCF-7 的增殖率，將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期，其可能的機(jī)制是油茶皂苷通過E2F1 介導(dǎo)激活p53 非依賴性途徑，p53 非依賴性途徑進(jìn)而誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡［11］。那么油茶皂苷對血管瘤細(xì)胞是否有抑制作用呢？

血管瘤主要包括真性血管瘤及血管畸形兩大類，是嬰兒出生及出生后不久所得的一種先天性良性腫瘤，病因及發(fā)病機(jī)制未明［12］。目前，臨床常用的治療方式效果一般，且存在一定的不良反應(yīng)［13］。尋找和研究高效低毒的藥物是血管瘤在治療方面的重要課題之一，本研究發(fā)現(xiàn)，油茶皂苷對EOMA細(xì)胞體外增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，AO 染色后觀察40 mg·L-1油茶皂苷導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)變化現(xiàn)象。查文獻(xiàn)可知油茶皂苷在濃度50～200 mg·L-1對人正常肝細(xì)胞（LO2）和腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）有一定的細(xì)胞毒性作用［14］。因此細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)采用的濃度是20 mg·L-1及40 mg·L-1油茶皂苷，結(jié)果顯示，凋亡率分別為9.5%、14.0%，細(xì)胞G0/G1 期比例增加，而S期比例減少。

綜上所述，油茶皂苷可抑制血管瘤細(xì)胞的增殖，其可能的機(jī)制是將EOMA 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。油茶皂苷有望成為治療血管瘤的新型藥物，但仍需進(jìn)一步研究。