阿迪拉·吐爾遜塔依，田永芝，何詩冰，努爾亞·艾尼外爾，范琳惠，約日耶提·薩力，塔吉古麗·阿不里克木

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學(xué)實驗室 干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

阿魏屬于阿魏屬(FerulaL.)，歸類為傘形科(Umbelliferae)、芹亞科 (Apioideae)、前胡族(Peucedaneae)、阿魏亞族(Femlinae)。阿魏屬植物大多分布于內(nèi)陸干旱、荒漠地區(qū)[1]，是多年生一次結(jié)果的草本。全世界約有150 余種，主要分布在歐洲南部地中海地區(qū)以及中亞鄰近地區(qū)。我國約有26種，1個變種，分布在東北、山西、西藏、云南、江蘇和新疆等地區(qū)；其中，產(chǎn)于新疆的有20種，主要分布在伊寧、阜康、托里、塔城、烏恰等地區(qū)。不同種類的阿魏屬植物生長的土壤類型有所不同，如新疆阿魏生長在灰鈣土上，阜康阿魏生長在荒漠灰鈣土上[2]。

阿魏屬植物的主要化學(xué)活性成分包括倍半萜、香豆素和多硫化合物等[3]。阿魏具有解毒、抗炎、抗過敏、抗高血壓等功效，對血液循環(huán)、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)都有影響[4]。早在古波斯就已將阿魏屬植物作為藥材[5]。國務(wù)院發(fā)布的“野生藥材資源保護管理條例”中，新疆阿魏被列為二級保護重要野生藥材物種[6]。阿魏酸(圖1)最初發(fā)現(xiàn)于阿魏植物的種子和葉子中，是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的酚酸，化學(xué)名為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一[7]。阿魏酸微溶于冷水，可溶于熱水，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，稍溶于乙醚，難溶于苯，且pH 值穩(wěn)定性好。阿魏酸見光易分解，具有較強的抗氧化性[5]。

圖1 阿魏酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of ferulic acid

新疆阿魏中含有的阿魏酸具有抗癌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抑菌消炎、抑制血小板聚集及廣譜的抗變態(tài)反應(yīng)的作用。阿魏酸安全無毒，具有良好的藥理作用和生物活性，在醫(yī)藥、保健品、化妝品原料等方面有較高的應(yīng)用價值[8]。阿魏酸在中藥阿魏、升麻、當歸、酸棗仁等中含量較高，是其有效成分之一[9]。植物細胞壁是阿魏酸的重要來源，阿魏酸在細胞中與木質(zhì)素和纖維素發(fā)生酯化，主要通過酯鍵與多糖和木質(zhì)素交聯(lián)，利用酶法進行水解，可以斷裂酯鍵將阿魏酸釋放出來[10]。目前，從植物中提取阿魏酸的方法很多，主要有超臨界流體萃取法、微波提取法、超聲波提取法等[11]。與其它提取方法相比，超聲波輔助法具有提取效率高、提取時間短、操作簡單、能耗低等優(yōu)點，具有較高的推廣和使用價值[12]。

研究[13]表明，阿魏酸分子易透過皮膚，直接作用于病變部位，在充分闡釋其作用機制的基礎(chǔ)上，有望將阿魏酸開發(fā)成功效型化妝品，用于色素性皮膚病的預(yù)防或治療[14]。阿魏酸對酪氨酸酶的抑制活性為天然安全的美白劑開發(fā)和食品保鮮技術(shù)如延緩果蔬、飲料類褐變提供了理論基礎(chǔ)[15]。鑒于此，作者以阿魏酸提取率為指標，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化新疆阿魏中阿魏酸的超聲波輔助酶法提取工藝，并采用酪氨酸酶多巴速率氧化法評價阿魏酸抑制酪氨酸酶活性，擬為阿魏酸的有效提取及其活性研究提供參考依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

阿魏，于2017年12月采自新疆伊犁。

阿魏酸標準品；木聚糖酶；無水乙醇；實驗用水為蒸餾水。

KQ-500B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；臺式低速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；UV2800型紫外分光光度計；恒溫水浴鍋。

1.2 阿魏酸的提取及阿魏酸效應(yīng)組分的制備

將新疆阿魏的根莖粉碎成粉后晾干。精確稱取阿魏粉末2.00 g，按一定料液比加入60%乙醇溶液，置于超聲功率為500 W、超聲頻率為 40 kHz 的超聲波清洗儀中，在一定提取溫度下提取一定時間；加入適量的木聚糖酶，置于50 ℃水浴鍋中酶解45 min后，于100 ℃沸水浴滅酶 5 min；過濾，濾液倒入EP管中，3 000 r·min-1離心 8 min，上清液即為阿魏酸提取液。

將最佳條件下提取的阿魏酸提取液經(jīng)大孔吸附樹脂分離后，用乙醇梯度洗脫，得到阿魏酸效應(yīng)組分，此組分中阿魏酸含量達到49.59%。

1.3 阿魏酸提取率的測定

1.3.1 檢測波長的確定

以60%乙醇溶液作為空白對照，對阿魏酸標準溶液進行全波長掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸在323 nm處有最大特征吸收峰。因此，以323 nm作為檢測波長。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取阿魏酸標準品2.3 mg，用1 mL 60%乙醇溶液溶解，配制濃度分別為46 mg·L-1、23 mg·L-1、11.5 mg·L-1、5.75 mg·L-1、2.875 mg·L-1的阿魏酸標準溶液，測定323 nm處吸光度。以阿魏酸濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為：A=0.0512c+0.1807，R2=0.9976。

1.3.3 阿魏酸提取率的計算

吸取0.5 mL阿魏酸提取液，用60%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，測定323 nm處吸光度，進行3次重復(fù)實驗，吸光度取平均值。根據(jù)標準曲線方程計算阿魏酸濃度，按式(1)計算阿魏酸提取率。

(1)

式中：c為提取液中阿魏酸濃度，mg·L-1；V為提取液體積，L；n為稀釋倍數(shù)；m為阿魏粉末質(zhì)量，mg。

1.4 提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

稱取阿魏粉末2.00 g，分別考察料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，g∶mL，下同)、提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min)、提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、酶加量(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)對阿魏酸提取率的影響，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面實驗，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗的因素與水平

1.5 阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應(yīng)組分對酪氨酸酶的抑制活性

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法測定阿魏酸抑制酪氨酸酶活性。在96孔培養(yǎng)板中進行反應(yīng)，總反應(yīng)體系200 μL：2.5 mmol·L-1DL-Dopa[左旋多巴(DL-β-3，4-Dopa)]40 μL；25 U·mL-1酪氨酸酶40 μL；測試藥物40 μL；67.0 mmol·L-1PBS緩沖液80 μL。調(diào)零孔僅加67.0 mmol·L-1PBS緩沖液200 μL。將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃水浴箱中孵育20 min，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔溶液在490 nm處吸光度(A490)，每組實驗重復(fù)測試8次。按式(2)計算酪氨酸酶活性。

(2)

式中：A為加酶不加藥反應(yīng)體系的A490值；A1為未加酶及藥反應(yīng)體系的A490值；A2為同時加入酶及藥反應(yīng)體系的A490值；A3為只加藥不加酶反應(yīng)體系的A490值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對阿魏酸提取率的影響

在提取溫度為 50 ℃、提取時間為 20 min、酶加量為 1.0%的條件下，考察料液比對阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對阿魏酸提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of ferulic acid

從圖2可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，阿魏酸提取率逐漸升高，當料液比為1∶12時，提取率達到最高；隨后提取率稍微下降。因此，料液比選擇1∶12較為適宜。

2.1.2 提取時間對阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶10、提取溫度為50 ℃、酶加量為1.0%的條件下，考察提取時間對阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對阿魏酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of ferulic acid

從圖3可知，當提取時間由10 min延長至20 min時，阿魏酸提取率快速升高；但繼續(xù)延長提取時間，阿魏酸提取率反而下降。這可能是由于，提取時間過長會破壞阿魏酸的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降。因此，提取時間選擇20 min較為適宜。

2.1.3 提取溫度對阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶12、提取時間為20 min、酶加量為1.0%的條件下，考察提取溫度對阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對阿魏酸提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of ferulic acid

從圖4可知，隨著提取溫度的升高，阿魏酸提取率先升高后降低；當提取溫度為 50 ℃時，提取率達到最高。這可能是因為，提取溫度過高，阿魏酸結(jié)構(gòu)可能被破壞或者使植物組織軟化。因此，提取溫度選擇50 ℃較為適宜。

2.1.4 酶加量對阿魏酸提取率的影響

在料液比為1∶10、提取時間為20 min、提取溫度為50 ℃的條件下，考察酶加量對阿魏酸提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶加量對阿魏酸提取率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction rate of ferulic acid

從圖5可知，當酶加量由 0.8%增至1.2%時，阿魏酸提取率逐漸升高；繼續(xù)增大酶加量，阿魏酸提取率明顯下降。因此，酶加量選擇1.2%較為適宜。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果(表2)

利用Minita18軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y=1.9918+0.0016A+0.1455B-0.0617C+0.1353D+0.0398A2-0.2296B2+0.0133C2-0.3730D2-0.0181AB-0.0176AC-0.0050AD-0.0818BC+0.2103BD+0.0328CD。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

對響應(yīng)面模型進行統(tǒng)計學(xué)處理，方差分析結(jié)果如表3所示，標準化效應(yīng)如圖6所示。

從表3、圖6可知，模型P=0.010，所建模型極顯著。因此，該模型的擬合程度良好，回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義，可以利用該模型對阿魏酸提取率進行分析。對模型中回歸方程的各項系數(shù)進行顯著性檢驗，可知一次項B、D及交互項BD影響顯著，二次項B2、D2

表3 響應(yīng)面模型的方差分析

圖6 標準化效應(yīng)圖Fig.6 Diagram of standardized effect

影響極顯著。表明，料液比和提取溫度對阿魏酸提取率有顯著影響，各因素對阿魏酸提取率的影響大小依次為：料液比(B)>提取溫度(D)>提取時間(C)>酶加量(A)。

2.2.2 響應(yīng)面分析

提取溫度與料液比、酶加量、提取時間的交互作用對阿魏酸提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7所示，多響應(yīng)預(yù)測結(jié)果如表4所示。

從圖7可知，料液比對阿魏酸提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。料液比和提取溫度的交互影響較為顯著，與方差分析的結(jié)果一致。從表4可知，新疆阿魏中阿魏酸的預(yù)測最佳提取工藝條件為：酶加量1.4%、料液比1∶13.19、提取時間10 min、提取溫度50.3 ℃，在此條件下，阿魏酸提取率為2.202%。

表4 多響應(yīng)預(yù)測結(jié)果

2.3 阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應(yīng)組分對酪氨酸酶活性的抑制作用(圖8)

從圖8可知，阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應(yīng)組分均對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性的特點，進一步表明阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應(yīng)組分均可以通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑色素的合成。

3 結(jié)論

以阿魏酸提取率為指標，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化新疆阿魏中阿魏酸的超聲波輔助酶法提取工藝，并采用酪氨酸酶多巴速率氧化法評價阿魏酸抑制酪氨酸酶活性。結(jié)果表明，新疆阿魏中阿魏酸的最佳提取工藝條件為：酶加量1.4%、料液比1∶13.19(g∶mL)、提取時間10 min、提取溫度50.3 ℃，在此條件下，阿魏酸提取率為2.202%。阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效應(yīng)組分均對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性的特點?？蓪Π⑽核徇M行結(jié)構(gòu)改造和修飾，以開發(fā)出活性更強、毒副作用更小的阿魏酸類衍生物。

圖8 阿魏酸(a)及新疆阿魏中阿魏酸效應(yīng)組分(b)對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibition of tyrosinase activity of ferulic acid and effective components of ferulic acid from Ferula sinkiangensis K.M.Shen.