姜 媛，丁 寧，胡學軍*

(1.大連大學醫(yī)學院，遼寧 大連 116000；2.大連大學 醫(yī)學研究中心，遼寧 大連 116622)

目前，重組蛋白已被廣泛應用于臨床治療、醫(yī)學檢驗、環(huán)境監(jiān)測等領域[1]。低成本高效的純化重組蛋白是蛋白生產(chǎn)的關鍵技術。通常采用各種色譜柱進行蛋白質純化，該方法同時需要輔助設備，比如蛋白質分離純化系統(tǒng)[2]。而類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，ELPs)的出現(xiàn)給純化重組蛋白提供了新的途徑。

1973年，Urry等發(fā)現(xiàn)天然彈性蛋白疏水區(qū)域中含有大量的Val-Pro-GIy-Val-Gly(VPGVG)重復氨基酸序列[3]。ELPs是根據(jù)重復五肽氨基酸序列人工合成的溫度敏感的蛋白質聚合物(VPGVG)n，具有響應溫度變化的可逆相變性質[4-6]。因此，近年來ELPs因其具有明顯的可逆相變特性而備受關注[7]。ELPs在低于其可逆相變溫度(inverse transition temperature，ITT)下可溶于水溶液，但在高于ITT時變成不溶性聚集體[8]。隨機的單個ELPs鏈在達到ITT之前，隨著溫度的升高開始呈現(xiàn)β-轉構象，接著是β-螺旋構象，然后在達到ITT時相互堆疊形成 “扭曲的細絲”并相互結合形成不溶性聚集體。此過程是可逆的，當溫度降低到ITT以下時，聚集體重新溶于溶液中[9](圖1)。

圖1 ELPs可逆相變機理Fig.1 Inverse transition mechanism of ELPs

研究[10-13]發(fā)現(xiàn)，當ELPs基序與另一蛋白融合時，ELPs的可逆相變性質得以維持。由此推斷ELPs允許重組蛋白的非色譜熱刺激相分離。自此ELPs便作為純化標簽參與蛋白質純化。雖然ELPs標簽與現(xiàn)有純化標簽均可用于標準化重組蛋白的純化過程，但現(xiàn)有純化標簽的一個共同缺點是：大多數(shù)依賴于親和層析，成本較高，特別是大規(guī)模制備時。相比之下，ELPs標簽的純化過程簡單而直接，可以顯著降低重組蛋白的生產(chǎn)成本[14]。Hassouneh團隊[2]將ELPs作為一種純化標簽，當加熱到溫度低于ITT時，采取多次可逆相變循環(huán)(inverse transition cycle,ITC)技術成功純化了ELPs融合蛋白。到目前為止，ITC技術已成功用于純化不同種類蛋白質[10,12,15]。ITC技術主要是依據(jù)ELPs標簽特有的可逆相變特性[16-17]，通過改變ITT來改變ELPs重組蛋白的狀態(tài)(圖2)。該過程需要適當?shù)娜芤涵h(huán)境，通常添加鹽溶液，如NaCl溶液(1～3 mol·L-1)、硫酸銨溶液(0.4～1.0 mol·L-1)或檸檬酸鈉溶液(0.15～0.50 mol·L-1)[18],然后進行升溫以誘導ELPs重組蛋白聚集沉淀和離心，隨后降溫，在所需緩沖液中再次溶解沉淀蛋白。在大多數(shù)情況下，兩到三輪的升溫離心步驟足以純化得到所需的蛋白質。ITC技術不需要昂貴的色譜設備、樹脂和試劑，儀器配置簡單，僅用常規(guī)離心機或過濾裝置即可，并且所得蛋白質的純化量及純度與親和色譜所得的基本一致。因此,ITC技術是一種非常經(jīng)濟有效且易于放大的純化技術。作者對ELPs標簽相變條件的優(yōu)化、ELPs標簽與靶蛋白重組方式的優(yōu)化、ELPs標簽的切除及ELPs標簽在純化重組蛋白中的應用的研究進展進行綜述。

圖2 采用ITC技術純化ELPs標簽蛋白示意圖[3]Fig.2 Schematic diagram for purification of ELPs tag protein by ITC technique[3]

1 ELPs標簽相變條件的優(yōu)化

最常用的ELPs有五肽序列(VPGXG)n，其中X為除脯氨酸以外的任何氨基酸占據(jù)的客體殘基，既可以是單個氨基酸，也可以是氨基酸的組合，n表示實現(xiàn)所需的ELPs鏈長度。在ELPs設計中，ELPs的客體殘基組成和長度是兩個正交的參數(shù)，可以用來控制ITT[16，19]。親水性客體殘基會提高ITT，而疏水性客體殘基會降低ITT。脯氨酸不能用作客體殘基，因為它破壞了ELPs的可逆相變性質[20]。對于相同五肽重復序列組成的不同長度ELPs，ELPs長度和分子質量增加會導致ITT降低[8]。ELPs的濃度也會對ITT造成影響，隨著ELPs濃度的增加，ITT呈對數(shù)式降低[21]。同時在溶液環(huán)境中，溶液中鹽濃度和溶液pH值也會影響ELPs的ITT。由于水分子和疏水基團之間的極性越強，疏水水合作用越弱，因此提高有序化的共溶劑鹽的濃度也會降低ITT[22-23]。當溶液pH值為客體氨基酸的pKa值時，蛋白離子化殘基部分最少，ITT最低[24]。ELPs標簽的ITT選擇對目標蛋白分離純化過程十分重要。若ELPs標簽的ITT太高，加熱溫度過高容易影響目標蛋白的穩(wěn)定性，導致其在高溫條件下發(fā)生變性。同時客體殘基的性質也會對ITC技術中雜蛋白的產(chǎn)生量造成影響,疏水性太強的客體殘基ELPs標簽產(chǎn)生更多的雜蛋白[2]。因此，應優(yōu)先選擇在較溫和條件下就可進行高效分離重組蛋白的短肽ELPs標簽。表1為幾種已成功廣泛應用于重組蛋白純化的ELPs標簽。

表1 幾種已用于重組蛋白純化的ELPs標簽

2 ELPs標簽與靶蛋白的重組方式的優(yōu)化

ELPs在N-或C-末端與靶蛋白的融合基因水平使它們易于被開發(fā)為廉價的實驗室非色譜純化技術[14,27]。靶蛋白的融合點與ELPs融合蛋白的表達水平和表達活力有關系。ELPs標簽在目標蛋白的C端或N端沒有固定的模式可循，如果目標蛋白的表達水平很高，ELPs標簽在N端可能會干擾目標蛋白的正確折疊。在這種情況下，將ELPs標簽設計到靶蛋白的C端可能更合適。如果目標蛋白的表達水平相對較低，ELPs標簽設計在目標蛋白的N端，從而增強靶蛋白的可溶性表達。它可能通過與未折疊的目標蛋白形成疏水作用，防止蛋白質聚集，促進折疊，最終維持ELPs的空間構象[28-29]。在優(yōu)化ITC的過程中，發(fā)現(xiàn)當ELPs標簽在目標蛋白的C-末端融合時，其蛋白質產(chǎn)量比在目標蛋白的N-末端融合時高出約50%～90%[30]。

3 ELPs標簽的切除

與其它純化標簽類似，ELPs標簽需要在純化后從目標蛋白中分離出來。最初通過在ELPs標簽和特定靶蛋白之間設計蛋白酶切割位點來實現(xiàn)。相關實驗表明，在融合蛋白中插入煙草蝕刻病毒(tobacco etch virus,TEV)或重組蛋白識別位點，在最終的純化步驟后利用蛋白酶來切斷酶識別位點，這一步驟將遵循附加溫度循環(huán)步驟，最終將ELPs標簽從目標蛋白中切除。盡管這一過程簡單有效，但蛋白酶位點的殘留氨基酸仍留在目標蛋白上，這可能導致免疫原性問題或影響蛋白活性[31-33]。

內含肽的發(fā)現(xiàn)給ELPs標簽的切除提供了新思路。常用的內含肽系統(tǒng)有兩種：一種是基因工程篩選的變異小分子內含肽，利用特定pH值和溫度可以引發(fā)其C-末端發(fā)生快速的自身剪切反應；另一種是天然小分子內含肽，在反應體系中加入硫醇后，在其N-末端可以發(fā)生自我剪切反應。內含肽系統(tǒng)大幅度地提高了ELPs標簽特異性切除效率[26，34-35]。這兩種內含肽系統(tǒng)通過滲透壓、pH值和溫度的變化或硫醇的加入，可以同時啟動選擇性的可逆沉淀反應和內含肽自裂反應[36]。與傳統(tǒng)的蛋白酶切ELPs標簽方法相比，避免了酶切反應過程緩慢和切除反應后分離蛋白酶的過程，這不僅大幅度降低了分離純化成本，并且提高了重組蛋白的純化效率。但使用這種方法，需要評估pH值變化或硫醇添加對最終蛋白質的物理、化學性質產(chǎn)生的影響及其它任何可能性。

4 ELPs標簽在純化重組蛋白中的應用

4.1 簡化蛋白質的純化過程

融合標簽技術的最初設計是依據(jù)目標蛋白與純化基質之間不發(fā)生任何直接的相互作用，來避免發(fā)生蛋白質變性的可能性，最終用于純化重組蛋白[37-41]。現(xiàn)實驗室常用親和層析、離子交換層析、疏水層析等層析技術分離純化重組蛋白[42]。其中親和層析是最為高效的分離純化方法，其原理為偶聯(lián)特異親和配基吸附介質、分離純化目標蛋白[43]。 常用于親和層析的純化標簽谷胱甘肽巰基轉移酶蛋白、鈣調蛋白結合肽、FLAG標簽、S肽標簽等雖然可以滿足大多數(shù)生物應用需求，但都對融合蛋白展示了高的特異性,同時用于固定其配基蛋白的樹脂成本較高,而且結合能力較低，操作費時，因此生產(chǎn)成本較高，并不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。短肽ELPs純化標簽與其它標簽相比有很明顯優(yōu)勢:其純化目標蛋白采取ITC技術，利用ELPs融合的蛋白質的可逆溶解度和可溶性-不溶性相變行為純化目標蛋白。ITC技術不僅成本低，而且效率高，極大地簡化了純化過程，所以ITC技術可應用于較大規(guī)模生產(chǎn)純化重組蛋白。

4.2 提高重組蛋白的產(chǎn)量

由于外源蛋白對于宿主菌的異質性,當外源蛋白在宿主菌內表達時,宿主菌會產(chǎn)生保護性反應，即調動各種機制來阻止外源蛋白過量表達，導致目標蛋白表達量降低[42]。相關實驗表明，當外源蛋白融合ELPs純化標簽后,能有效提高重組蛋白的產(chǎn)量。到目前為止,ELPs純化標簽通過ITC技術可應用到不同宿主中進行表達純化重組蛋白,見表2。

表2 在不同表達系統(tǒng)中的ELPs融合蛋白

ELPs融合蛋白經(jīng)內質網(wǎng)修飾后形成雙層膜包被的蛋白體，從而避免了正常的生理降解。表達的ELPs融合蛋白會逐漸積累在細胞中，大大提高了目標蛋白的表達量[50-51]。Meyer團隊[8]利用His6 純化標簽和不同分子量ELPs純化標簽(9 kDa和36 kDa)純化硫氧還蛋白，其短肽ELPs純化標簽的蛋白表達量[(137±21) mg·L-1]高于傳統(tǒng)His6純化標簽的蛋白表達量[(93±13) mg·L-1]。

5 展望

ELPs具有可逆相變的性質，溫度低于ITT時保持可溶性，溫度高于ITT時可逆地形成聚集體，并且與其它蛋白融合表達時，ELPs的可逆相變特性保持不變；同時由于ELPs來源于原彈性蛋白，因此具有生物相容性、無毒性和非免疫原性。ELPs的獨特性質使其成為一類理想的融合標簽，可在蛋白質純化等生物、醫(yī)學方面應用。ELPs標簽純化過程簡單且經(jīng)濟，主要包括在ELPs的ITT上下循環(huán)蛋白質，然后離心獲得目標蛋白，無需進行層析。但研究發(fā)現(xiàn)，pH值觸發(fā)的ITC技術似乎更簡單、更有效，省略了加熱和冷卻循環(huán)，但在不同pH值環(huán)境下ELPs的重組蛋白有可能發(fā)生生理性溶解。此外，雖然已有大量的研究表明ELPs融合標簽在蛋白質純化中的有效性，并且短肽ELPs標簽已被證明適用于在4～37.5 ℃的不同鹽中的蛋白質生產(chǎn)和純化，但是目前該技術還沒有完全發(fā)展到可以大規(guī)模生產(chǎn)應用階段。關于ELPs標簽是否會影響目標蛋白的翻譯后修飾、產(chǎn)量和活性，及殘留氨基酸(在ELPs標簽被切除后可能殘留)對靶蛋白活性和免疫原性的影響方面仍然需要進一步研究。

綜上，盡管目前需要繼續(xù)評估ELPs標簽對大規(guī)模蛋白質純化時所用設備、體積和系統(tǒng)等方面的可擴展性問題，但是該技術在快速、低成本、大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質方面有巨大的應用潛力。總而言之，ELPs標簽將會在生產(chǎn)生物活性靶蛋白和大規(guī)模純化目標蛋白方面有更廣泛的應用，同時也為進一步實現(xiàn)更低的材料成本和更簡化的操作步驟提供了新思路。