董 歌，徐仁扣①

(1.中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，江蘇 南京 210008；2.中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，北京 100049)

重金屬在土壤-作物系統(tǒng)內(nèi)的遷移、富集及對生態(tài)環(huán)境的危害引起了全世界的高度關(guān)注[1]。玉米既是全球也是中國第一大谷物，在保障糧食安全和優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占有重要地位[2]，然而農(nóng)田土壤重金屬污染引起的食品安全問題不容樂觀。例如，在湖南嚴重污染的農(nóng)田土壤上，19個玉米品種籽粒Cd質(zhì)量含量范圍為0.14～0.32 mg·kg-1，超標(biāo)率達100%[3]。另外，玉米對Cu2+較為敏感[4]，易受Cu2+的毒害。因此，減緩玉米根系對Cu2+和Cd2+的吸收和積累具有重要實際意義。

植物根系表面帶有豐富的官能團(—OH、—NH2和—H2PO4等)，質(zhì)子的締合與解離使其表面帶有電荷，且以負電荷為主，可為陽離子提供潛在吸附位點[5]。根系主要通過形成化學(xué)鍵和靜電吸引方式吸附重金屬離子，植物種類和環(huán)境條件的改變會影響根系表面官能團類型，也會改變吸附位點數(shù)量和類型[6]，使得根系表面吸附重金屬的化學(xué)形態(tài)發(fā)生變化并影響重金屬在植物組織中的分布[4]。

土壤pH是影響重金屬在土壤固液相分配的最重要因素[7]，可通過改變重金屬形態(tài)影響重金屬生物有效性，進而影響重金屬的生物毒性和植物對其的吸收[8]。而外源陽離子和有機酸也會影響重金屬的生物有效性。陽離子如Ca2+和Mg2+可與重金屬陽離子競爭根系表面吸附位點，減少重金屬在根系表面吸附量，進而緩解其毒性[9]。pH值為4.5時，Ca2+和Mg2+緩解小麥根系受Cu2+毒害的效果最佳[10]。植物在受重金屬脅迫時會分泌有機酸，并通過有機酸與重金屬形成可溶性絡(luò)合物緩解其毒害[11]。有機酸羧基和羥基數(shù)目及其在碳鏈中的相對位置影響有機酸與Cu2+和Cd2+的絡(luò)合能力[6]，進而影響其生物有效性。陽離子和有機酸對緩解玉米受重金屬毒害的機制還有待探究。因此，筆者著重研究Cu2+和Cd2+的植物毒性及其與玉米根系表面電化學(xué)性質(zhì)和重金屬形態(tài)分布的關(guān)系，研究結(jié)果可為修復(fù)重金屬污染土壤和保障食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及生長條件

供試玉米品種為蘇玉20，購于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。將玉米種子置于φ=10%的H2O2溶液中消毒10 min后，沖洗干凈，在蒸餾水中浸泡4 h，播于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，再放入恒溫培養(yǎng)箱〔溫度為(25±2) ℃，相對濕度為70%〕中在黑暗條件下催芽48 h。最后，挑選露白的種子在人工生長室〔14 h光照，27 ℃/10 h黑暗，20 ℃；光照強度(以光子計)為375 μmol·m-2·s-1；相對濕度為70%〕中水培2 d，再轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)液(pH值為4.5)中進行培養(yǎng)。

營養(yǎng)液組分(mmol·L-1)：(NH4)2SO4，2.0；NaNO3，12.0；NaH2PO4·2H2O，1.0；K2SO4·5H2O，3.0；MgSO4·2H2O, 3.0；CaCl2，4.0。營養(yǎng)液其他組分(μmol·L-1)：MnCl2·4H2O，9.15；CuSO4·5H2O，0.32；ZnSO4·7H2O，0.77；(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.02；H3BO3，46.26；FeSO4·7H2O-EDTA， 20.0。每2 d更換1次營養(yǎng)液，第15天時取根系分別用于Cu2+和Cd2+吸附試驗。

1.2 玉米根伸長抑制試驗

玉米根伸長試驗參照ISO標(biāo)準(zhǔn)(11269-1)[12]。取培養(yǎng)48 h后的玉米幼苗分別置于含0.5 mmol·L-1CaCl2以及0.5、1、2、5、10、20、40、60和80 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2溶液(pH值為4.5)中，每個處理10株幼苗，重復(fù)3次，暗培養(yǎng)48 h，采用式(1)計算根系相對伸長率(E)：

E=(T2-T1)/(C2-C1)×100%。

(1)

式(1)中，C1為對照處理前根長，cm；C2為對照處理48 h后根長，cm；T1為重金屬處理前根長，cm；T2為重金屬處理48 h后根長，cm。

當(dāng)研究不同陽離子對玉米根系受重金屬毒害的影響時，選定Cu(NO3)2和Cd(NO3)2溶液濃度為40 μmol·L-1，溶液中還含有0.5 mmol·L-1CaCl2背景電解質(zhì)及1或2 mmol·L-1KCl、NH4Cl、CaCl2和MgCl2，其他試驗條件同上。

當(dāng)研究不同有機酸對玉米根系受重金屬毒害的影響時，選定Cu(NO3)2和Cd(NO3)2溶液濃度為40 μmol·L-1，溶液還含0.5 mmol·L-1CaCl2背景電解質(zhì)及1 mmol·L-1草酸、檸檬酸、酒石酸或蘋果酸，其他試驗條件同上。

1.3 Cu2+和Cd2+吸附/解吸試驗

將生長15 d的玉米根系置于去離子水中浸泡1 h，旨在去除根系表面多余的養(yǎng)分離子。再將根與莖分離，用蒸餾水清洗3次，用濾紙小心吸干其根系表面水分。取約10 g鮮根裝在0.05 mm孔徑尼龍網(wǎng)袋中，在磁力攪拌條件下將根與1 L含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2溶液反應(yīng)2 h，取出并用去離子水清洗3次，吸干表面水分，然后依次將根系置于500 mL 0.1 mol·L-1KNO3、0.05 mol·L-1EDTA溶液(pH為6.0)和0.01 mol·L-1HCl溶液中1 h，分別提取植物根系表面吸附的交換態(tài)、絡(luò)合態(tài)和沉淀態(tài)重金屬離子[6]。最終將浸提過的根系清洗后，置于溫度為50 ℃烘箱中烘干至恒重。采用原子吸收分光光度法測定提取液中Cu2+和Cd2+含量。

當(dāng)研究不同陽離子對玉米根系吸附重金屬的影響時，配制含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2及1 mmol·L-1KCl、NH4Cl、CaCl2或MgCl2的混合液，溶液pH為4.5。將根系分別置于該混合液中吸附2 h后，用上述浸提液依次提取交換態(tài)、絡(luò)合態(tài)和沉淀態(tài)Cu2+和Cd2+。

當(dāng)研究不同有機酸對玉米根系吸附重金屬的影響時，配制含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2及1 mmol·L-1草酸、檸檬酸、酒石酸或蘋果酸的混合液，溶液pH為4.5。其他步驟同上。

當(dāng)研究不同pH值對玉米根系吸附重金屬的影響時，配制含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值分別至4.0、4.5和5.0。其他步驟同上。

1.4 根系表面Zeta電位的測定

取約10 g玉米鮮根，與初始濃度為40 μmol·L-1Cu2+和Cd2+溶液反應(yīng)2 h，以蒸餾水為對照。反應(yīng)過程中控制pH保持恒定為4.5。吸附完成后，用蒸餾水清洗根系3次，擦去多余水分，風(fēng)干，再用流動電位法測定根系Zeta電位[13]。具體做法：將風(fēng)干根剪成2 cm長，取0.25 g填充樣品池，用稀鹽酸和稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)1.5 L流動液pH分別為3.76、4.65、5.50、6.86和7.66，再用NaCl調(diào)節(jié)溶液電導(dǎo)率為80 μS·cm-1；將流動液泵入測量池后平衡90 min，更換不同pH流動液在最大流量下平衡10 min后測量流動電位ΔE和測量池兩端的液壓差ΔP，用Helmholtz-Smoluchowski方程計算Zeta電位(ζ)[14]：

(2)

式(2)中，ΔE為流動電勢，mV；ΔP為液體壓力差，Pa；μ為溶液的粘滯系數(shù)，Pa·S；ε為電解質(zhì)溶液的介電常數(shù)，F(xiàn)·m-1；ε0為真空介質(zhì)的介電常數(shù)，F(xiàn)·m-1；κ為溶液電導(dǎo)，S·m-1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理和LSD多重分析(P<0.05)，并進行差異顯著性檢驗，采用字母標(biāo)記法進行標(biāo)記。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度Cu2+和Cd2+脅迫對玉米根系伸長的影響

由圖1可知，在pH為4.5條件下，玉米根系相對伸長率隨著Cu2+和Cd2+濃度的升高而顯著下降，Cu2+和Cd2+濃度分別與含該重金屬溶液中玉米根相對伸長率呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.571和-0.710(P<0.05)。上述結(jié)果表明Cu2+和Cd2+對根系的毒害抑制根系生長，且這種毒害隨重金屬濃度的升高而增大。當(dāng)Cu2+和Cd2+濃度均為40 μmol·L-1時，玉米根系的伸長均趨于停止，故選此濃度研究不同陽離子和不同有機酸對玉米幼苗根系伸長的影響。圖1還表明，當(dāng)Cu2+和Cd2+濃度相同時，玉米幼苗在含Cu2+營養(yǎng)液中的根系相對伸長率明顯低于含Cd2+營養(yǎng)液中的根系，例如，當(dāng)Cu2+和Cd2+濃度均為1 μmol·L-1時，玉米根系相對伸長率分別為52.40%和96.23%。這說明Cu2+對玉米根系生長的抑制作用大于Cd2+，因為前者對植物的毒性大于后者[15]。

2.2 pH對玉米幼苗根表吸附的Cu2+和Cd2+形態(tài)分布的影響

重金屬離子與根系表面結(jié)合后才會對根系產(chǎn)生毒害。將玉米根系吸附的Cu2+和Cd2+區(qū)分為交換態(tài)、絡(luò)合態(tài)和沉淀態(tài)[16]。交換態(tài)指由于靜電引力作用而吸附于根表面負電荷位上的重金屬離子，絡(luò)合態(tài)指與根系表面官能團形成表面絡(luò)合物的重金屬，沉淀態(tài)指以物理方式附著在根系表面的金屬氫氧化物和氧化物沉淀。由圖2可知，吸附在玉米根系表面的Cu2+主要以交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)存在，當(dāng)pH為4.5和5.0時，沉淀態(tài)Cu2+含量較低；而吸附在玉米根系表面的Cd2+主要以交換態(tài)存在，絡(luò)合態(tài)和沉淀態(tài)含量均較低。Cu2+與有機官能團之間的絡(luò)合能力比Cd2+與有機官能團之間的絡(luò)合能力強，這是玉米根系表面絡(luò)合態(tài)Cu2+含量高于絡(luò)合態(tài)Cd2+的主要原因[6]。當(dāng)pH值相同時，玉米根系表面吸附的交換態(tài)和沉淀態(tài)Cu2+含量也明顯高于相應(yīng)形態(tài)的Cd2+。例如，當(dāng)pH為4.5時，交換態(tài)、絡(luò)合態(tài)和沉淀態(tài)Cu2+含量分別是相應(yīng)形態(tài)Cd2+含量的1.22、4.36和2.45倍。由于玉米根系對Cu2+的吸附親和力和吸附量均高于其對Cd2+，因此Cu2+對玉米根系生長的抑制作用大于Cd2+。

隨著pH的升高，玉米根系表面吸附的交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)Cu2+含量均顯著增加(P<0.05)，其吸附的交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)Cd2+含量也均顯著增加(P<0.05)(圖2)。植物根系表面負電荷主要來源于羧基和酚羥基等官能團的離解，隨著介質(zhì)pH升高，這些官能團的離解度增加，根系表面負電荷增加，對重金屬陽離子的靜電吸附量增加，這是玉米根系表面交換態(tài)Cu2+和交換態(tài)Cd2+隨pH升高而增加的主要原因。玉米根系Zeta電位的測定結(jié)果證明了根系表面負電荷隨pH的這一變化趨勢(圖3)，結(jié)果表明玉米根系Zeta在所研究的pH為3.8～7.7范圍內(nèi)均為負值，說明在這一pH范圍內(nèi)玉米根系帶凈負電荷；隨著介質(zhì)pH升高，玉米根系Zeta電位絕對值增加，說明根系表面負電荷增多。重金屬陽離子主要與根系表面有機陰離子形成絡(luò)合物，隨著pH升高，根系表面陰離子數(shù)量增多，與Cu2+和Cd2+形成表面絡(luò)合物的數(shù)量相應(yīng)增加。Zeta電位測定結(jié)果也為Cu2+和Cd2+在玉米根表面形成表面絡(luò)合物提供了證據(jù)。根據(jù)表面化學(xué)原理，陽離子的靜電吸附不改變吸附劑表面電荷，但陽離子的專性吸附使吸附劑表面負電荷減少，吸附劑的Zeta電位也發(fā)生相應(yīng)變化。圖3顯示，與沒有吸附重金屬的對照相比，吸附了Cu2+和Cd2+的玉米根系Zeta電位-pH曲線向正值方向位移，且吸附Cu2+的玉米根系Zeta電位-pH曲線位移更顯著，說明Cu2+和Cd2+與玉米根系表面官能團形成了表面絡(luò)合物，且Cu2+與根表的絡(luò)合作用大于Cd2+，此與圖2結(jié)果一致。圖3還表明，吸附Cu2+的玉米根系Zeta電位-pH曲線與對照之間的差值也隨介質(zhì)pH的升高而增大，此與根表絡(luò)合態(tài)Cu2+的量隨pH升高而顯著增加的結(jié)果一致，說明根系吸附的絡(luò)合態(tài)Cu2+數(shù)量越多，根系表面電荷的變化越大。

玉米根系表面吸附的沉淀態(tài)Cu2+含量在pH為4.5條件下達到最高，在pH為5.0條件下有所下降；沉淀態(tài)Cd2+含量隨pH升高而增加，但在pH為4.5～5.0之間時無顯著差異。隨pH升高，沉淀態(tài)Cu2+和Cd2+含量增加是2種金屬離子的水解作用增強所致。因為Cu2+的水解能力比Cd2+強，它們的水解常數(shù)pK分別為6.5和9.7[17]，這是相同pH條件下玉米根表沉淀態(tài)Cu2+含量高于沉淀態(tài)Cd2+含量的主要原因。

2.3 不同種類陽離子對玉米根系受Cu2+和Cd2+毒害的緩解作用與機制

不同價態(tài)養(yǎng)分陽離子能夠緩解玉米幼苗根系受Cu2+和Cd2+的毒害，當(dāng)K+、NH4+、Mg2+和Ca2+與Cu2+或Cd2+共存時玉米根系相對伸長率大于單一Cu2+或Cd2+體系(圖4)。4種陽離子在1和2 mmol·L-12個濃度水平下均對Cd的毒性有顯著緩解作用，但只有Mg2+和Ca2+對Cu的毒性有顯著緩解作用，K+、NH4+對Cu毒性緩解作用不顯著。4種陽離子對Cd2+植物毒性的緩解作用大于其對Cu2+。例如，與Cu2+單一脅迫的根系相比，1 mmol·L-1NH4+、K+、Ca2+和Mg2+使玉米根系相對伸長率分別增加0.48、0.48、8.44和3.32百分點；對Cd2+脅迫體系4種陽離子使玉米根系相對伸長率分別提高3.42、1.53、13.19和4.26百分點。4種陽離子對Cu2+和Cd2+毒性的緩解作用由大到小依次為Ca2+>Mg2+>NH4+≥K+。

研究不同種類陽離子對玉米根表吸附Cu2+和Cd2+及其形態(tài)分布的影響(圖5)，結(jié)果表明共存陽離子均降低了玉米根表對3種形態(tài)Cu2+和Cd2+的吸附量，二價陽離子的影響效果達到顯著水平。例如，與單一重金屬處理相比，Ca2+使交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)Cu2+含量分別降低69.06%和77.55%，使交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)Cd2+含量分別降低93.00%和84.75%；Mg2+使交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)Cu2+含量分別降低60.66%和72.73%，使交換態(tài)和絡(luò)合態(tài)Cd2+含量分別降低55.6%和38.82%。共存陽離子主要通過與重金屬陽離子競爭根表吸附位點來減少玉米根系對Cu2+和Cd2+的吸附，帶負電荷的根表對二價陽離子的靜電吸引力大于一價陽離子，這是相同濃度條件下Ca2+和Mg2+對根系吸附Cu2+和Cd2+的抑制作用大于K+和NH4+的主要原因。

共存陽離子Ca2+、Mg2+、K+和NH4+抑制了玉米根系對Cu2+和Cd2+的吸附，從而緩解了2種重金屬對玉米根系的毒害(圖4)。隨著共存陽離子濃度的升高，它們對根系吸附Cu2+和Cd2+的抑制作用增加，相應(yīng)地對2種重金屬毒性的緩解作用也增強，這與對大麥的相關(guān)研究結(jié)果[9]相一致。

2.4 不同種類有機酸對玉米根系受Cu2+和Cd2+毒害的緩解作用與機制

圖6顯示，1 mol·L-1有機酸顯著緩解玉米幼苗根系受Cu2+和Cd2+的毒害，其緩解作用由強到弱為草酸>檸檬酸>酒石酸≈蘋果酸。與單一重金屬處理相比，草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸分別使玉米根系受Cu2+脅迫時的相對伸長率增加4.44、2.49、2.22和1.27倍，使玉米根系受Cd2+脅迫時的相對伸長率增加2.06、1.78、1.59和1.44倍。

有機酸也主要通過抑制玉米根系對Cu2+和Cd2+的吸附來緩解重金屬對根系的毒性。當(dāng)有機酸與Cu2+或Cd2+共存時，玉米根系吸附的交換態(tài)、絡(luò)合態(tài)和沉淀態(tài)Cu2+和Cd2+含量均有不同程度的減小(圖7)。與單一Cu2+處理相比，添加草酸、檸檬酸、蘋果酸和酒石酸分別使玉米根表交換態(tài)Cu2+含量降低91.34%、88.65%、74.38%和73.86%，使絡(luò)合態(tài)Cu2+分別降低96.13%、80.60%、58.82%和52.96%。與單一Cd2+處理相比，添加草酸、檸檬酸、蘋果酸和酒石酸分別使玉米根表交換態(tài)Cd2+含量降低62.13%、48.21%、40.31%和46.72%，分別使絡(luò)合態(tài)Cd2+含量降低57.56%、28.37%、20.33%和27.20%。4種有機酸對玉米根系吸附Cu2+和Cd2+抑制作用的大小順序與它們對玉米根系受2種重金屬毒害的緩解作用的大小順序一致。

在玉米根系受Cu2+和Cd2+短期脅迫時，有機酸通過與2種重金屬陽離子形成絡(luò)合物使其保留在溶液中，從而減小根系對重金屬陽離子的吸附量，減輕2種重金屬對根系的毒害。有機酸這2種作用的強弱主要取決于它們與重金屬陽離子絡(luò)合作用的強弱，絡(luò)合作用的強弱一般用絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)(lgK穩(wěn))表征。檸檬酸、酒石酸和蘋果酸與Cu2+形成絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)分別為5.90、3.20和3.42，與Cd2+形成絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)分別為3.12、2.80和2.36[18]，與這3種有機酸抑制玉米根系吸附2種重金屬陽離子的大小順序及緩解重金屬對根系毒性的大小順序基本一致。雖然草酸與2種重金屬陽離子形成絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)(4.84和2.75)小于檸檬酸，但草酸的酸離解常數(shù)pKa1(1.25)也小于檸檬酸(3.13)，因此，相同pH和有機酸濃度條件下，草酸體系比檸檬酸體系含有更多的有機陰離子，更有利于絡(luò)合物的形成。這是草酸對玉米根系吸附Cu2+和Cd2+的抑制作用及對2種重金屬毒性的緩解作用大于檸檬酸的主要原因。因此，有機酸與重金屬陽離子的絡(luò)合作用越強，它對植物根系吸附重金屬陽離子的抑制作用就越大，它緩解植物受重金屬毒害的效果就越顯著。

3 結(jié)論

(1)Cu2+和Cd2+通過在玉米根系表面的吸附對根系產(chǎn)生毒害并抑制根系生長，帶負電荷的根系表面對Cu2+的吸附親和力大于其對Cd2+，因此相同條件下Cu2+對根系的毒害大于Cd2+。

(2)Ca2+、Mg2+、K+和NH4+等共存陽離子通過與Cu2+和Cd2+競爭玉米根系表面的吸附點位而抑制根系對重金屬陽離子的吸附，從而緩解2種重金屬對根系的毒害。4種陽離子緩解根系受Cu2+和Cd2+毒害的作用由大到小依次為Ca2+、Mg2+、K+和NH4+，與這些陽離子競爭根系表面吸附位點的能力大小相一致。

(3)低相對分子質(zhì)量有機酸主要通過與Cu2+和Cd2+形成絡(luò)合物抑制2種重金屬陽離子在根系表面的吸附，從而緩解玉米受2種重金屬的毒害作用。4種有機酸緩解重金屬毒性的作用由大到小依次為草酸>檸檬酸>酒石酸≈蘋果酸，這與上述有機酸絡(luò)合Cu2+和Cd2+的能力大小順序基本一致。