王曉春,梁 麗,周煥英

(1.鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114016；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050)

有機(jī)氯農(nóng)藥(OCPs)是典型的持久性有機(jī)污染物，具有致癌、致畸和致突變的“三致”作用，因其高毒性、半揮發(fā)性、難降解性和生物蓄積性，環(huán)境中殘留的OCPs會通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康[1-6]。因此，建立簡單、快速、有效的有機(jī)氯農(nóng)藥檢測方法，對保證食品安全和保護(hù)人類健康具有重大的現(xiàn)實意義。

目前，有機(jī)氯農(nóng)藥的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)、高效液相色譜法(HPLC)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-9]，與之配套的前處理方法有固相萃取法(SPE)、固相微萃取法(SPME)、加速溶劑萃取法(ASE)、超臨界流體萃取法(SFE)和基質(zhì)固相分散萃取法(MSPD)等[10-14]。由于食品中有機(jī)氯農(nóng)藥含量低，基質(zhì)本底復(fù)雜，且分析前常需較復(fù)雜的前處理方法凈化，再經(jīng)濃縮后上樣分析，操作繁瑣耗時，靈活性不強(qiáng)，且前處理設(shè)備和裝置價格也相對較高。QuEChERS方法是由美國農(nóng)業(yè)部的Anastassiades等[15]于2003年首次提出并應(yīng)用于樣品前處理，該方法與SPE技術(shù)類似，利用吸附劑與基質(zhì)中雜質(zhì)間的相互作用，從而達(dá)到凈化目的。方法凈化徹底，提取效果好，污染小，回收率和精密度較高，分析速度快，且操作比SPE更簡便，可用于農(nóng)藥、抗生素和毒素等目標(biāo)物的提取凈化[16-19]，以及部分蔬菜和水果中有機(jī)氯殘留的檢測[20-26]。但這些方法存在儀器價格昂貴且操作復(fù)雜[20-21]或檢測的有機(jī)氯農(nóng)殘種類較少[22-25]且大部分為菊酯類農(nóng)殘等不足。另外，油菜和橙子作為色素含量比較大的蔬菜和水果，未見采用QuEChERS凈化的相關(guān)報道。基于此，本文建立了基于QuEChERS凈化/氣相色譜法測定蔬菜及水果中16種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的快速檢測方法，方法簡單、快速、準(zhǔn)確、高效，可用于蔬菜及水果樣品中有機(jī)氯殘留的快速篩查和定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A氣相色譜配電子捕獲檢測器(美國Agilent公司),TGL-16C臺式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),手動移液器(德國艾本德公司)；凈化管：QuEChERS Clean-up Kit A(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB)和QuEChERS Clean-up Kit B(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+7.5 mg GCB)(美國安捷倫公司)；PuriMag Si-C18磁珠(西安齊岳生物科技有限公司)。

乙腈(農(nóng)殘級，F(xiàn)isher Scientific公司)；乙酸(北京百靈威公司)；標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量濃度為10 μg/mL的16種OCPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括甲氧滴滴涕、六氯苯、α-666、β-666、γ-666、七氯、環(huán)氧七氯、艾氏劑、α-硫丹、β-硫丹、狄氏劑、異狄氏劑、p,p′-DDE、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDT(北京百靈威公司)；質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的上述16種有機(jī)氯單標(biāo)(天津阿爾塔科技有限公司)。黃瓜、油菜、橙子和蘋果樣品均購于天津某大型超市。實驗用水為Millipore高純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混標(biāo)儲備液：取質(zhì)量濃度為10 μg/mL的16種OCPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，置于1 mL棕色容量瓶中，加入900 μL乙腈，混勻后得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的OCPs混標(biāo)儲備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取不同體積的1 μg/mL的16種OCPs的混標(biāo)儲備液，采用逐級稀釋法，分別配制質(zhì)量濃度為2、5、10、25、50、100 μg/L的16種OCPs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品10 g至50 mL離心管中，加入15 mL含1%冰乙酸的乙腈溶液，劇烈振蕩1 min，以8 000 r/min離心5 min。取上清液用含1%冰乙酸的乙腈溶液定容至25 mL；定量轉(zhuǎn)移2 mL定容后的上清液至凈化管中，渦旋混合1 min，以8 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，供氣相色譜分析。空白實驗除不稱取蔬菜樣品外，其余步驟同上。

1.4 色譜條件

色譜柱：DB-35 MS柱(30 m×250 μm，0.15 μm)；檢測器：ECD；載氣：高純(99.999 9%)氮氣；載氣流速：1.5 mL/min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：300 ℃。色譜柱升溫程序：初始溫度120 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至300 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

圖1 16種OCPs化合物的色譜圖

圖2 QuEChERS Clean-up Kit A凈化管(A)和QuEChERS Clean-up Kit B凈化管(B)凈化效果對比以及凈化管A與C18磁性材料結(jié)合處理后的色譜圖(C)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

考察了16種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的色譜條件，對色譜柱、柱箱溫度、進(jìn)樣條件等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，選取DB-35 MS柱(30 m×250 μm，0.15 μm)并采用“1.4”色譜條件時，16種有機(jī)氯農(nóng)藥可達(dá)到基線分離，且色譜峰形尖銳對稱(圖1)。

2.2 提取溶劑的選擇

乙酸乙酯、丙酮和乙腈均為農(nóng)殘分析常用的提取溶劑。其中乙酸乙酯易于提取蠟質(zhì)、脂肪等非極性提取物，但其不溶于水，對水中溶解度稍大的有機(jī)氯目標(biāo)物回收率較低。丙酮易于提取樣品中的色素，但因其與水互溶較難分離。乙腈是蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)分析方法中的首選提取溶劑。由于本文所選樣品均含有大量水分，據(jù)文獻(xiàn)可知以乙腈為提取劑時的提取效果較好，因此選擇乙腈為提取溶劑。同時，實驗還考察了乙腈中添加乙酸時對蔬菜和水果中OCPs的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加酸后回收率有較大改善，且酸度強(qiáng)弱對大部分OCPs目標(biāo)物的回收率幾乎無影響，只對少數(shù)幾種OCPs目標(biāo)物的回收率有較大影響，當(dāng)乙酸含量為0.5%～2%時，16種目標(biāo)OCPs的回收率比較理想。因此，實驗選用含1%乙酸的乙腈溶液為提取劑。

2.3 凈化條件的選擇

常用凈化劑有N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅膠鍵合相(C18)和碳黑(GCB)等。本實驗考察了QuEChERS Clean-up Kit A(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB)和QuEChERS Clean-up Kit B(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+7.5 mg GCB) 2種凈化管對實際樣品的凈化效果(圖2A、B)。結(jié)果顯示，采用QuEChERS Clean-up Kit A凈化后溶液均呈無色狀態(tài)，而采用QuEChERS Clean-up Kit B凈化后，溶液呈不同程度的顏色。由于實驗選取的蔬菜和水果樣品中色素含量偏高，因此本實驗選用QuEChERS Clean-up Kit A凈化管凈化，16種OCPs的回收率為70.0%～110%。另外，進(jìn)一步考察了凈化管A與C18磁性材料結(jié)合對待測物回收率的影響。將凈化后的溶液與50 mg的PuriMag Si-C18待磁珠混合后渦旋5 min，待磁分離后過0.22 μm微孔濾膜測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后的未加標(biāo)樣品本底的色譜峰與單獨采用QuEChERS Clean-up Kit A凈化的本底幾乎一致(見圖2C)，且16種OCPs農(nóng)藥的回收率與僅使用凈化管A的結(jié)果差別不大，而環(huán)氧七氯的回收率顯著降低。綜合考慮實驗成本，最終選擇QuEChERS Clean-up Kit A凈化管進(jìn)行凈化。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 工作曲線、檢出限與定量下限以16種OCPs混標(biāo)溶液確定GC最優(yōu)工作條件，同時輔以各OCPs化合物的單標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確定性。采用基質(zhì)加標(biāo)法確定各不同基質(zhì)下的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以消除基質(zhì)效應(yīng)，保證方法的準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確稱取空白黃瓜、油菜、蘋果和橙子勻漿樣品10 g于50 mL離心管中，加入0、50、125、250、625、1 250、2 500 μL 1 μg/mL的OCPs混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在優(yōu)化條件下處理并測定，以不加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，獲得不同基質(zhì)下16種OCPs的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。連續(xù)測定OCPs標(biāo)準(zhǔn)品11次，以3倍信噪比(S/N≥3)計算方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10計算定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，在2～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃瓜、油菜、蘋果和橙子樣品中的16種OCPs化合物的線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99,LOD為0.16～2.9 μg/L，LOQ為0.5～8.9 μg/L，表1為其中油菜與橙子中16種OCPs的線性方程及相關(guān)系數(shù)。

表1 16種OCPs的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

圖3 黃瓜樣品的加標(biāo)色譜圖

2.4.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別選取4種蔬菜水果(黃瓜、油菜、蘋果和橙子)在優(yōu)化條件下處理并測定，確認(rèn)無目標(biāo)化合物后以其為空白樣品，分別向其中添加高、中、低3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到含量分別為5.0、10.0、40.0 μg/kg的加標(biāo)樣品，每個濃度水平重復(fù)測定6次。結(jié)果顯示：在5.0～40.0 μg/kg 加標(biāo)水平內(nèi)，16種OCPs在4種基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率為70.1%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.23%～5.2%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足上述蔬菜和水果中16種常見OCPs的檢測要求。圖2為16種OCPs在空白黃瓜樣品的加標(biāo)色譜圖,表2為16種OCPs在油菜和橙子中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表2 16種OCPs在油菜和橙子中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對購于天津某超市的黃瓜、油菜、橙子和蘋果樣本中的16種OCPs進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示均未檢出，說明本方法中相關(guān)OCPs農(nóng)藥的使用得到了有關(guān)部門的高度重視和監(jiān)管，未出現(xiàn)過度使用的現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

本研究將QuEChERS凈化技術(shù)與氣相色譜相結(jié)合，建立了4種蔬菜及水果(黃瓜、油菜、橙子、蘋果)中16種OCPs農(nóng)藥殘留的檢測方法。通過對黃瓜、油菜、橙子和蘋果的方法學(xué)評價，發(fā)現(xiàn)各組分在2.0～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好，樣品平均加標(biāo)回收率為70.1%～119%，RSD為0.23%～5.2%。方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、高效的特點，可用于蔬菜及水果樣品中有機(jī)氯殘留的快速篩查和定量檢測。