龔愛琴,金黨琴

(揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

艾滋病又名獲得性免疫缺陷綜合征，是由人免疫缺陷病毒感染導(dǎo)致的一種致死性較高的疾病。目前國際上治療艾滋病的藥物有6類30多種，分別為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶、整合酶、融合酶和細(xì)胞內(nèi)β趨化因子受體(CCR5)抑制劑[1]。ACC007屬于第三代口服非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，中文名為3-{[3-乙基-2,6-二氧-5-(丙基-2-基)-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基]羰基}-5-甲基苯腈。作為一類抗艾滋病新藥，ACC007具有優(yōu)良的抗病毒活性和安全性，在2017年獲得國家“十三五”重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)[2]。 藥品質(zhì)量直接關(guān)系到用藥者健康和生命安全，藥物從研發(fā)到臨床必須進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，包括對藥物制劑進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)及對生物體液中的藥物濃度進(jìn)行監(jiān)測，最常見的是對血清中藥物濃度進(jìn)行監(jiān)測以了解藥動(dòng)學(xué)特征[3]。目前關(guān)于ACC007含量的測定方法報(bào)道很少。黃潔瓊[4]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定復(fù)方制劑和比格犬血漿中的ACC007，但液質(zhì)聯(lián)用儀價(jià)格較高，一般實(shí)驗(yàn)室難以普及。當(dāng)分析基體比較復(fù)雜、物質(zhì)含量較低的樣品時(shí)，常需結(jié)合使用分離富集技術(shù)。近年來分離富集技術(shù)向著簡單化、微型化、有機(jī)試劑消耗最小化方向發(fā)展，其中液相微萃取技術(shù)顯示了較高的樣品萃取能力和良好的富集效果[5-7]。疏水性離子液體具有在水中溶解度小、揮發(fā)性低、毒性低、環(huán)境友好等特點(diǎn)，逐漸取代傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑而作為萃取劑使用。當(dāng)使用離子液體作為萃取劑時(shí)，由于離子液體黏度較大，常需使用分散劑(甲醇[8]、乙腈[9]、丙酮[10-11]等)以改善離子液體在樣品溶液中的分散效果，提高萃取率，但會增大有機(jī)試劑消耗量。而使用超聲對溶液進(jìn)行萃取時(shí)，溶液中會形成亞微米尺寸的液滴，增大互不相溶的兩相間接觸面，加速物質(zhì)轉(zhuǎn)移，甚至無需分散劑也可獲得很高的萃取率，從而減少有機(jī)溶劑的使用[12-13]。

本文首次采用超聲輔助離子液體分散液液微萃取/高效液相色譜(HPLC)法測定人血清及藥片中的ACC007。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在超聲的作用下無需分散劑即可獲得較高的萃取率(>94.0%)。該方法減少了有機(jī)溶劑的使用，簡單、環(huán)保，可為ACC007的藥動(dòng)學(xué)和藥物研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)，配紫外檢測器；KQ3200超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；L2-4K臺式低速離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；FE28 pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多)。

ACC007標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(含量99.7%)與藥片(標(biāo)示量75.0 mg/片)均由江蘇艾迪制藥有限公司提供。

離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C8mimPF6]、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C6mimPF6]、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C4mimPF6]購于上海笛柏生物科技有限公司。乙醇、甲醇、冰乙酸、乙酸鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，甲醇為色譜純，其他均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 溶液配制

0.10 mg/mL ACC007標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.10 g ACC007標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于燒杯中，用適量乙醇溶解后，轉(zhuǎn)入容量瓶中并用乙醇定容至100 mL，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，置于暗處保存。使用前取適量用乙醇稀釋至0.10 mg/mL。

pH 4.5的緩沖溶液：稱取5.0 g三水合乙酸鈉，用水溶解后，加入6.3 mL冰乙酸，用水稀釋至500 mL，于酸度計(jì)上調(diào)至pH 4.5。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備ACC007藥片：取5片準(zhǔn)確稱重，研磨均勻，精密稱取約1片質(zhì)量的藥品粉末，用乙醇溶解定容至100 mL，過0.45 μm濾膜，取0.1 mL續(xù)濾液萃取測定。

血清樣品：取健康志愿者的血清1.0 mL，加入1.0 mL 1.0 mg/mL的ACC007標(biāo)準(zhǔn)溶液和8.0 mL乙腈，以1 200 r/min離心15 min[14]，取0.5 mL上清液萃取分析。

1.3.2 萃取過程在10 mL離心管中，依次加入適量的ACC007標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液、2.0 mL緩沖溶液、80 μL 離子液體[C8mimPF6]，用水稀釋至刻度線，搖勻。超聲10 min后取出，于5 ℃冷卻15 min，以2 500 r/min 離心5 min，溶液分層，下層即為離子液體萃取相。將萃取相用乙醇稀釋至1.0 mL，待測。

1.3.3 HPLC法測定色譜柱：Dionex C18(4.60 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水(90∶10)，流速為1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

圖1 未萃取藥物(a)、萃取試劑空白(b)與萃取后藥物(c)的吸收曲線

圖2 離子液體種類對ACC007萃取率的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

實(shí)驗(yàn)分別測定了未萃取藥物、萃取試劑空白、萃取后藥物在200～350 nm的吸收曲線，結(jié)果見圖1。由圖可知：藥物有2個(gè)吸收峰(圖1a)；萃取試劑空白在藥物第2個(gè)吸收峰處(260 nm)無吸收(圖1b)；藥物經(jīng)萃取后第1個(gè)吸收峰消失(圖1c)，這可能是以萃取試劑空白作參比，而空白產(chǎn)生的吸收比樣品強(qiáng)所致。由于萃取試劑空白在第2個(gè)吸收峰無吸收，對測定無干擾，實(shí)驗(yàn)選擇檢測波長為260 nm。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇離子液體的水溶性、粘度、萃取能力等會影響萃取率，當(dāng)離子液體陰離子部分固定不變時(shí)，這些特性與離子液體的陽離子部分有關(guān)。[C4mimPF6]、[C6mimPF6]和[C8mimPF6]3種疏水性離子液體在水中的溶解度分別為18.8、7.5、2.0 μg/L[15]，因此分別考察了200 μL [C4mimPF6]、150 μL [C6mimPF6]、60 μL [C8mimPF6]在不使用分散劑的情況下對ACC007萃取率的影響(圖2)。萃取率計(jì)算如下：萃取率=CexVex×100%/(C0V0)，式中Cex、C0分別為萃取相和萃取溶液中ACC007的質(zhì)量濃度(μg/mL)，Vex、V0分別為萃取相和萃取溶液的體積(mL)。由圖2可知，少量的[C8mimPF6]即可達(dá)到較高的萃取效果，故后續(xù)研究采用[C8mimPF6]作為萃取劑。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了[C8mimPF6]用量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACC007的萃取率隨著離子液體用量的增加而增大，[C8mimPF6]用量為70 μL時(shí)達(dá)到最大萃取率(94.7%)，之后萃取率隨離子液體用量的增加基本不變。為便于操作，最終選擇離子液體[C8mimPF6]的用量為80 μL。

2.2.2 溶液pH值的選擇考察了溶液pH值在3.0～6.0范圍內(nèi)對ACC007萃取率的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)溶液pH為4.5時(shí)萃取率達(dá)到最大值(95.0%)，此后萃取率隨著pH值的增大而降低?？赡苁且?yàn)锳CC007發(fā)生了酮式和烯醇式結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，其在水中的溶解度隨著pH值增加而增大，導(dǎo)致萃取率下降。實(shí)驗(yàn)中控制萃取溶液pH值為4.5。

2.2.3 萃取時(shí)間的選擇超聲輔助離子液體分散液液微萃取是一種平衡萃取，超聲波有利于疏水性離子液體形成微小液滴分散于水相中，從而加速萃取物的轉(zhuǎn)移。固定超聲頻率為40 kHz，實(shí)驗(yàn)考察了超聲時(shí)間(2、5、7、10、15、20 min)對萃取率的影響，結(jié)果表明ACC007的萃取率隨著超聲時(shí)間的增加而增大，當(dāng)超聲時(shí)間為10 min時(shí)萃取率達(dá)到最大值(95.4%)，之后隨超聲時(shí)間的增加萃取率基本不變。實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為10 min。

2.2.4 冷卻時(shí)間與離心時(shí)間的選擇超聲時(shí)溶液溫度升高會增大離子液體的溶解度，冷卻可降低其在水中的溶解度而有利于相分離。在5 ℃冷卻溫度下，實(shí)驗(yàn)考察了冷卻時(shí)間對ACC007萃取率的影響，發(fā)現(xiàn)冷卻時(shí)間超過10 min時(shí)即可相分離完全，ACC007的萃取率在94.0%以上。為保證分相完全，實(shí)驗(yàn)選擇冷卻時(shí)間為15 min。

冷卻后立即離心，在轉(zhuǎn)速2 500 r/min條件下，考察了離心時(shí)間對ACC007萃取率的影響，發(fā)現(xiàn)離心時(shí)間為5 min時(shí)即可相分離完全，因此實(shí)驗(yàn)選擇離心時(shí)間為5 min。

2.2.5 離子強(qiáng)度的選擇通過加入不同量的1 mol/L NaCl考察了離子強(qiáng)度對萃取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10 mL萃取體系中，當(dāng)NaCl的加入量超過0.9 mL(離子強(qiáng)度約為0.09 mol/L)時(shí)ACC007的萃取率會明顯下降。實(shí)驗(yàn)使用的緩沖溶液濃度為0.2 mol/L，計(jì)算得離子強(qiáng)度為0.04 mol/L，可滿足離子強(qiáng)度的要求。

2.2.6 溶液體積的選擇考察了溶液體積對ACC007萃取率的影響，發(fā)現(xiàn)溶液體積超過15 mL后萃取率下降明顯，原因可能是溶液體積增大使得離子液體在水中的溶解量增大，萃取能力降低所致。本研究控制溶液體積為10 mL，萃取后為降低離子液體黏度的影響，將萃取相用乙醇稀釋至1.0 mL后測定。

圖3 經(jīng)萃取后ACC007的色譜圖

2.3 分析應(yīng)用

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)圖3顯示了空白藥片(曲線1)、空白血清(曲線2)、ACC007標(biāo)準(zhǔn)溶液(曲線3)、ACC007藥片(曲線4)、加標(biāo)血清(曲線5)經(jīng)萃取后的色譜圖。由圖可知，ACC007的出峰時(shí)間為3.6 min，空白藥片與空白血清在該處均無色譜峰，表明空白藥片和空白血清中共存組分對測定無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系與檢出限通過student's檢驗(yàn)法比較工作曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，考察了樣品基體對測定的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過萃取和分析ACC007標(biāo)準(zhǔn)溶液而得，工作曲線則通過萃取和分析加標(biāo)空白藥片和血清而得。在優(yōu)化條件下，以峰面積對ACC007的質(zhì)量濃度繪制曲線。結(jié)果表明，在P<0.05時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與工作曲線斜率無明顯差異，因此實(shí)際樣品分析時(shí)均采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。由表1 可知，ACC007的線性范圍為0.20～10.0 μg/mL，在空白藥片和血清中的檢出限(S/N=3)分別為0.062、0.068 μg/mL。

表1 不同樣品中ACC007的線性參數(shù)及檢出限

2.3.3 重現(xiàn)性分別配制質(zhì)量濃度為2.0、5.0、10.0 μg/mL的樣品溶液，按照本方法萃取后測定峰面積，每個(gè)濃度平行測定6次，ACC007峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.8%～4.3%，表明方法的重現(xiàn)性較好。

2.3.4 樣品測定與回收率采用本方法測定了藥片與血清中ACC007的質(zhì)量濃度(見表2)，將測定結(jié)果換算成原始量為：73.8 mg/片(藥片)，98.6 μg/mL(血清)。而ACC007藥片的標(biāo)示量為75.0 mg/片，加標(biāo)血清中ACC007的質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL。結(jié)果顯示，測定值與標(biāo)示值無顯著性差異。

在2.0、5.0、10.0 μg/mL加標(biāo)水平下，對上述藥片和血清樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，ACC007的回收率為90.5%～103%，RSD為2.9%～5.1%(見表2)，表明方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好，可以滿足樣品的測定要求。

表2 樣品測定及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文建立了超聲輔助離子液體分散液液微萃取/HPLC測定血清和藥片中ACC007含量的分析方法。該方法無需使用分散劑，萃取率可達(dá)94.0%以上，減少了有機(jī)溶劑的使用和環(huán)境污染，降低了實(shí)驗(yàn)成本；超聲作用提高了萃取效率。準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、檢出限等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可用于血清和藥物的分析，為ACC007的藥動(dòng)學(xué)和藥物研究提供了分析技術(shù)支持。