林婉芳，翟文穎，劉有芹

(生物基材料與能源教育部重點實驗室,華南農業(yè)大學 材料與能源學院,廣東 廣州 510642)

生物毒性大的重金屬主要指汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷，而其它如鎳、鈷、銅、鋅及硒等毒性雖小，但超過一定值也會產生毒性[1]。由于重金屬不能同有機污染物一樣被分解破壞，土壤、水體一旦發(fā)生重金屬污染，則危害嚴重，治理成本高[2]。重金屬主要來源于礦山開采、冶煉電鍍、農藥、輕工等行業(yè)，并通過各種路徑進入水、土壤甚至大氣中。在生物鏈的放大作用下，重金屬逐漸富集進入動物、植物、水產品中，最終進入人體內，造成重金屬中毒。輕則引起貧血、肌肉酸疼、神經障礙、骨骼和肝腎損害，重則導致死亡[3]。因此，開展重金屬的高靈敏、高選擇性分析方法研究對于重金屬污染防護、食品安全具有重要意義。目前，重金屬的分析方法有紫外可見分光光度法[4]、原子吸收光譜法[5]、原子發(fā)射光譜法[6]、原子熒光光譜法[7]、X射線熒光光譜法[8]、電感耦合等離子體質譜法[9-10]、色譜法[11]等。然而這些方法需要貴重儀器，成本高，分析步驟繁瑣，不利于快速分析。因此，研究快速、低成本的重金屬分析方法具有重要理論與應用價值。

電化學分析具有原理簡單、靈敏度高、選擇性好、應用范圍廣等特點，易于開發(fā)成便攜式及用于在線場景，能為環(huán)保、食品及生物監(jiān)測等領域提供高效檢測手段。為提高重金屬電化學分析的靈敏度、穩(wěn)定性及選擇性，人們設法采用各種復合材料改性電極表面以獲得特定功能。鍍汞膜電極最早用于重金屬分析，取得良好效果。但由于汞毒性較大，危害人們健康且污染環(huán)境，近年來逐漸被人們放棄使用[12]。鉍膜具有與汞膜類似形成“汞齊”合金的功能，能有效富集重金屬進而提高分析靈敏度，且其毒性小，成為研究的重要對象[13]。無機/有機復合材料的種類及活性位點多，在重金屬電化學分析領域研究極為廣泛[14-15]。眾所周知，重金屬進入人體后，能與酶或激素發(fā)生相互作用，導致功能失調，并引發(fā)中毒癥狀。而氨基酸作為蛋白質組成單元，含有多種官能團，能與重金屬發(fā)生配位反應，具有重金屬吸附富集功能[16]。因此氨基酸作為電極修飾材料在重金屬電化學分析領域具有良好的應用前景。然而，將氨基酸與鉍膜結合制備重金屬傳感器的研究鮮有報道。

本文制備了聚酪氨酸/鉍復合膜修飾玻碳電極，探討了最佳制備及測試條件，研究了復合膜電極的分析性能及抗干擾能力，并成功用于茶葉樣品中鉛含量的測定。研究結果對同類重金屬傳感器的開發(fā)具有重要參考價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660C電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM，Philips公司)；三電極體系：玻碳電極(GC，Ф3.0 mm)為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極，鉑片(15 mm×0.5 mm)為對電極；PHS-3C酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

Pb2+標準貯備溶液(1 000.0 mg/L,北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)。L-酪氨酸(Tyr)、磷酸鹽(PBS)、氯化鉀等均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 聚Tyr/GC電極的制備與表征

制備：GC電極依次在0.3 μm和0.05 μm Al2O3糊上拋光，然后在1∶1(體積比)硝酸、無水乙醇、水中超聲清洗，純氮氣吹干。將清洗干凈的GC電極放入含有Tyr的0.10 mol·L-1PBS緩沖溶液(pH 6.0)中循環(huán)伏安掃描所需圈數，即得聚Tyr/GC電極。

樣品處理：將市售茶葉樣品經研缽研磨粉碎，稱取1.5～2.0 g(精確至0.1 mg)置于小三角瓶中，加10.0 mL混合酸(硝酸+高氯酸=4∶1(體積比))浸泡過夜；將三角瓶置于可調式電熱板上消解直至冒白煙，當溶液剩余0.5～1 mL時，取下冷卻，消化液呈無色透明或略帶黃色。冷卻后將其轉入10 mL容量瓶中，用于支持電解質定容，混勻備用。同時做試劑空白。

測試：將三電極置于10.0 mL的0.10 mol·L-1PBS(pH 6.0)+5.0 mmol·L-1KCl+1.0 μmol·L-1Bi3+電解液中，系統穩(wěn)定后，加入待測Pb2+樣品，在一定電位富集一定時間，通過方波陽極溶出伏安法(SWASV)進行測量，記錄溶出電流，重復測量3次，取平均值。下次測定前，電極在0.5 V保持15 s，以清除電極表面殘余金屬及其它污染物。實驗過程中電解液均預先通入氮氣除氧，保持液面處于氮氣氛中。實驗在室溫條件(25±1) ℃下進行。

圖1 聚Tyr/GC電極制備的循環(huán)伏安圖

2 結果與討論

2.1 聚Tyr/GC電極的制備與表征

圖1為Tyr在玻碳電極表面聚合的循環(huán)伏安圖。從第1圈循環(huán)伏安圖可知，在0.850 V出現1氧化峰，屬于Tyr被氧化成陽離子自由基[17]，自由基很活潑，極易發(fā)生聚合；在-0.321 V出現相應還原峰。隨著掃描進行，氧化還原峰電流均逐漸增大，說明聚酪氨酸逐漸沉積于GC電極表面。掃描一定圈數后，電流趨于穩(wěn)定。

膜電極表面的電子交換性能可通過循環(huán)伏安法及交流阻抗譜進行表征。圖2A曲線a、b分別為[Fe(CN)6]3-/4-在GC及聚Tyr/GC電極上的循環(huán)伏安圖。從圖中可以看出，Tyr/GC電極上的峰形優(yōu)于GC電極，峰電流增大約22%，峰間距縮小了0.011 V，表明聚Tyr膜有利于[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的電子交換。曲線a、b氧化峰電流(μA)與掃描速率(V·s-1)的平方根成正比(圖略)，方程分別為：Ipa=18.56+216.0v1/2(r2=0.995 8);Ipa=14.59+285.0v1/2(r2=0.997 2)。依據Randles-Sevcik方程[18]：

Ip=2.69×105n3/2AD1/2cv1/2

式中A、Ip、D、n、v及c分別表示電極活性面積、峰電流、擴散系數、電子交換數、掃描速率及濃度。求得GC及聚Tyr/GC電極的電活性面積分別為5.82、7.68 mm2。聚Tyr膜增大了電極的電活性表面積，有利于Bi膜形成及Pb2+富集，提高檢測靈敏度。

圖2B曲線a、b分別為5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-在GC及聚Tyr/GC電極上的交流阻抗譜。阻抗譜圖中高頻區(qū)域的半圓直徑代表電子在電極上的電子傳遞阻抗[19]?？梢钥闯鲭娮釉诰跿yr/GC電極上的電子傳遞電阻較小，有利于提高Pb2+的響應靈敏度。以圖2B中所示等效電路進行擬合，GC及聚Tyr/GC電極上的電子傳遞阻抗分別約為573.6、193.1Ω，實驗結果與循環(huán)伏安圖一致。通過掃描電鏡對電極的表面形貌進行表征。裸GC電極(圖3A)表面光滑，而聚Tyr膜(圖3B)呈花狀分布于GC表面，進一步證明成功制備了聚Tyr膜修飾玻碳電極。

圖2 GC(曲線a)及聚Tyr/GC(曲線b)電極的循環(huán)伏安(A)及交流阻抗(B)圖

圖3 GC(A)及p-Tyr/GC(B)電極的SEM圖

圖4 酪氨酸濃度對0.10 μmol·L-1 Pb2+溶出峰電流的影響

2.2 制備條件的優(yōu)化

聚Tyr膜對Pb2+有富集作用，其形態(tài)對復合電極的分析性能有重要影響。圖4為制備聚Tyr/GC電極時單體Tyr濃度的影響。單體Tyr濃度大，氧化產生的自由基多，聚合產生的微粒中心多，膜則致密；單體濃度小，聚合微粒少，膜則較稀疏。從圖4可知，隨Tyr濃度的升高，Pb2+的溶出峰電流逐漸增大，但超過1.5 mmol·L-1時峰電流逐漸減小。進一步考察制備p-Tyr/GC電極時掃描圈數(5～30圈)的影響。結果顯示，圈數多，則聚合膜厚，重金屬離子配位中心多，有利于Bi3+及Pb2+離子富集，但膜太厚則會造成Pb2+離子擴散阻力，使得內部配體無富集作用；圈數少則配位活性中心少，不利于Pb2+離子富集且易于飽和。實驗測得Tyr的最佳濃度為1.5 mmol·L-1,最佳掃描圈數為15。

2.3 測試條件的優(yōu)化

測試介質對Pb2+溶出峰電流有重要影響。測試了BR、醋酸及PBS緩沖溶液中Pb2+的富集溶出行為，發(fā)現Pb2+在PBS溶液中的峰形良好，電流最大，后續(xù)研究采用PBS緩沖溶液。為了提高PBS緩沖溶液的導電性，加入5.0 mmol·L-1KCl。溶液pH值對Bi3+、Pb2+離子形態(tài)及聚合膜的配位能力也有較大影響。酸性過強則沉積時易析出氫，影響Pb2+離子的富集；堿性過強則對沉積及溶出電位有影響。從圖5A可知最佳測試液pH值為6.0，這與文獻結果一致[20]。Bi3+濃度也影響B(tài)i膜的原位形成。濃度過小則富集Pb2+離子的能力較弱；濃度過大則形成的Bi膜較厚，Pb2+離子的擴散阻力加大，不利于溶出峰電流的提高。實驗結果顯示，Bi的最佳濃度為1.0 μmol·L-1。

此外，不同金屬離子具有不同的沉積電位。沉積電位越負，金屬沉積速率越快，富集量越多，則溶出峰電流越大。但沉積電位太負，則一方面造成氫析出，另一方面潛在干擾物的溶出電流也可能增大。由圖5B可知，最佳沉積電位為-1.20 V。溶出電流與富集時間呈正相關，沉積時間長，則靈敏度高，獲得檢出限越低。通常應根據樣品中Pb含量的高低及分析效率綜合確定富集時間，本文后續(xù)研究采用富集時間300 s。

圖5 pH值(A)及富集電位(B)對0.10 μmol·L-1 Pb2+溶出峰電流的影響

圖6 GC(a)、p-Tyr/GC(b)、Bi/GC(c)及p-Tyr/Bi/GC(d)電極對0.10 μmol·L-1 Pb2+響應的SWASV圖

圖7 p-Tyr/Bi/GC復合膜電極對Pb2+的響應

2.4 不同電極性能的對比

圖6(a～d)為不同電極對0.10 μmol·L-1Pb2+響應的SWASV圖?？梢钥闯鰷y試液中有Bi3+時(曲線c、d)，溶出峰電流比無Bi3+(曲線a、b)時分別增加了60.6%和79.3%，說明富集時Bi膜的原位形成有利于Pb2+的富集，這可歸于Pb2+富集沉積時，共沉積形成了類似汞齊的鉍-鉛膜，使得溶出電流增大[21]。曲線b的峰電流比曲線a高約26.1%，說明聚Tyr膜有富集Pb2+離子的能力，這源于聚合膜上含有豐富的—NH2、—COOH基團，能與Pb2+離子形成配位吸附[22]。曲線d的峰電流最大，說明Bi/聚-Tyr復合膜對Pb2+具有協同富集作用，這為研制高靈敏Pb2+離子傳感器奠定了基礎。

2.5 分析性能

在最佳條件下，考察了p-Tyr/Bi/GC復合膜電極對不同濃度Pb2+響應的SWASV圖及線性關系(圖7)。結果顯示，隨著Pb2+濃度的增加，體系的溶出電流逐漸增加，且在0.01～0.16 μmol·L-1濃度范圍內呈良好線性關系，其檢出限(3S/k)為0.8 nmol·L-1。為了考察復合電極的穩(wěn)定性與重復性，在最佳條件下制備了6支電極，對0.10 μmol·L-1Pb2+樣品進行測試，得到溶出峰電流的相對標準偏差(RSD)小于5.3%。同一電極測試0.10 μmol·L-1Pb2+樣品，每天測試10次，連續(xù)測兩周，測得溶出峰電流的RSD小于3.9%。說明電極具有良好的穩(wěn)定性及重復性。為了評估本文研制的Bi/p-Tyr/GC復合膜電極性能，表1列出文獻類似Pb2+傳感器的實驗結果。數據表明本復合膜電極具有較高的靈敏度及較低檢出限，能滿足實際樣品的分析要求。

2.6 干擾研究

表1 不同Pb2+傳感器的分析性能比較

2.7 茶葉中鉛含量的分析

為進一步驗證p-Tyr/Bi/GC復合膜電極的可靠性，通過標準加入法對市場中3種茶葉樣品中鉛含量進行分析，結果見表2。測得鉛的回收率為90.6%～96.3%，RSD不大于3.9%。表中同時列出采用國家標準(GB/T 5009.12-2017)[29]中原子吸收法(AAS)的測試結果進行對照。結果顯示，二者的相對偏差小于4.1%，說明該復合膜電極的性能優(yōu)良、可靠，完全能用于實際樣品中鉛含量的分析。

3 結 論

本文通過循環(huán)伏安法及原位鍍鉍成功制備了鉍/聚酪氨酸復合膜修飾玻碳電極，顯示復合膜對Pb2+具有協同富集效應，有效提高了檢測靈敏度。復合膜電極具有良好的穩(wěn)定性、重復性，用于實際茶葉樣品中鉛的測定，具有良好的準確度及精密度。