孫瑩瑩，吳曉惠

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

前列腺癌作為一種嚴(yán)重的泌尿系統(tǒng)癌癥之一，是最常見的男性惡性腫瘤，對男性的健康狀況危害極大。自從1980年P(guān)apsidero課題組[1]首次闡明了前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)與前列腺癌的相關(guān)性，PSA就作為檢測前列腺病癥的最佳標(biāo)記物，長期用于男性前列腺癌的早期診斷。目前臨床上常用于PSA檢測的方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、色譜法和放射性免疫分析(RIA)法等[2-3]。然而，這些方法不僅操作復(fù)雜，還存在輻射傷害和環(huán)境污染等問題。因此，構(gòu)建一種快速、靈敏、準(zhǔn)確且無污染的分析方法用于檢測病人體內(nèi)的PSA成為人們努力的方向。

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)是化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物[4-6]。這種分析方法具有背景信號低、靈敏度高、自動化程度高、無污染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物分析、醫(yī)藥檢測、環(huán)境和食品檢測等領(lǐng)域[7-9]。電化學(xué)發(fā)光免疫分析是將電化學(xué)發(fā)光檢測和免疫分析相結(jié)合的免疫標(biāo)記分析技術(shù)，通過利用電化學(xué)發(fā)光試劑來標(biāo)記抗原或抗體后，進(jìn)行相應(yīng)的免疫反應(yīng)和理化步驟，記錄反應(yīng)前后電化學(xué)發(fā)光信號的差值，并對待測物的濃度進(jìn)行分析。這種方法不僅具有免疫分析技術(shù)的高特異性，而且具有電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度、低背景、無輻射污染等特點(diǎn)，被廣泛用于檢測與各種疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)及核酸[10-11]。然而，在實(shí)際臨床檢測中，目標(biāo)待測物的濃度往往很低，甚至達(dá)到痕量級別，為了提高傳感器的靈敏度，引入信號放大技術(shù)是實(shí)現(xiàn)痕量物質(zhì)定量檢測的重要手段[12]。

信號放大技術(shù)是一種增強(qiáng)信號強(qiáng)度的技術(shù)。對于電化學(xué)發(fā)光檢測，一般從兩個方面實(shí)現(xiàn)信號放大：①單位空間內(nèi)增加信號標(biāo)簽的數(shù)量；②在電化學(xué)發(fā)光過程中提高單個信號標(biāo)簽的發(fā)光效率。納米材料因其具有較大的比表面積、良好的電子傳遞能力以及優(yōu)秀的生物相容性，常作為一種信號放大的手段用于提高傳感器的靈敏度。如韓靜等[13]利用QDs-PAMAM-Pd/Au 納米材料作為生物探針，以GNRs/GO 作為基底構(gòu)建了電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測蘇丹紅I號。因GNRs/GO具有超大的比表面積，可增加包被抗原的負(fù)載量，從而有效地放大ECL信號；Wang等[14]制備了一種基于魯米諾發(fā)光體系的非標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測大腸桿菌。利用AgBr負(fù)載的N摻雜的3D石墨烯對魯米諾發(fā)光體系進(jìn)行催化，增加了魯米諾發(fā)光效率，最后達(dá)到信號放大效果。該方法對大腸桿菌的檢測范圍為0.5～500 cfu/mL，檢出限為0.17 cfu/mL。

二硫化鉬(MoS2)是一種性能優(yōu)異的過渡金屬二硫化物，由于其具有較大的比表面積、較高的催化活性和良好的光學(xué)性能，在能量轉(zhuǎn)換、儲存、催化、傳感等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[15-17]。然而，MoS2作為一種典型的半導(dǎo)體，其導(dǎo)電能力不夠理想，且水溶性較差，因此MoS2的改性和功能化對其在電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分重要。已有文獻(xiàn)表明，將碳納米材料摻雜在MoS2結(jié)構(gòu)中，可有效提高復(fù)合材料的導(dǎo)電能力和水溶性。因此，本課題組利用石墨烯和碳納米管作為支撐骨架，采用水熱法制備出具有三維花狀結(jié)構(gòu)的MoS2/GO/o-MWNTs 納米復(fù)合材料，并采用原位還原法將金納米粒子修飾在其花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)上。所得Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復(fù)合材料(AMGMs)不僅克服了單一MoS2導(dǎo)電性差、易聚集的缺點(diǎn)，其生物相容性也有所提高[18]。

本文利用已合成的AMGMs 納米復(fù)合材料作為固定化基底，結(jié)合“三明治”免疫夾心組裝法構(gòu)筑高靈敏的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了血清中PSA的高靈敏檢測。首先，以三維花狀的AMGMs作為傳感基底可提高抗體的負(fù)載量。其次，該納米復(fù)合膜優(yōu)良的導(dǎo)電性和生物相容性能夠加速反應(yīng)中電子傳遞的速率，同時最大程度地保持抗體活性，從而提高檢測效率，實(shí)現(xiàn)信號放大。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL響應(yīng)與PSA濃度的對數(shù)值呈正比,線性范圍為0.1 pg/mL～50 ng/mL,檢出限(S/N=3)為0.1 pg/mL。將該傳感器應(yīng)用于人血清樣品中PSA的檢測，所得抗原的加標(biāo)回收率為98.2%～106%,說明該方法的準(zhǔn)確性良好，具有極好的臨床應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)圖像在SHIMADZU SSX-550上測定。透射電子顯微鏡(TEM)圖像在Hitachi H-7650上測定。電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)在MPI-E型電化學(xué)發(fā)光檢測儀(西安瑞邁)上進(jìn)行，光電倍增管高壓為800 V，放大級數(shù)為3。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CHI 660B電化學(xué)工作站(上海辰華)上進(jìn)行。三電極系統(tǒng)：以修飾的玻碳電極(3 mm直徑)為工作電極 ，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)交流阻抗法研究傳感器的組裝過程，采用電化學(xué)發(fā)光法定量研究該傳感器對PSA的響應(yīng)信號。循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)在含1 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的PBS溶液中進(jìn)行。電化學(xué)交流阻抗實(shí)驗(yàn)以5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)為探針，在電位Eo=0.17 V下進(jìn)行，頻率范圍為0.1～100 000 Hz，交流電壓振幅為10 mV。

Anti-PSA Ab1(PSA抗體1)、生物素修飾的Anti-PSA Ab2-B(PSA抗體2)、PSA抗原、牛血清蛋白(BSA)購于上海生工生物工程公司；鏈霉親和素(SA)和三丙胺(TPrA)購于美國Sigma公司；三聯(lián)吡啶釕復(fù)合物(Ru complex，蘇州Suna科技有限公司)；多壁碳納米管(MWNTs，純度大于95%,深圳納米港有限公司)，氧化石墨烯(GO，南京吉倉納米科技有限公司)，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)、硫脲、氯金酸( HAuCl4)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的人體血清由沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院提供。所有試劑均為分析純且使用時未進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水為高純水(電阻系數(shù)≥18.2 MΩ·cm,Milli-Q,美國Millipore公司)，所用PBS緩沖液均為pH 7.4,濃度為0.1 mol/L。

1.2 Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復(fù)合材料的制備

Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復(fù)合材料(AMGMs)的合成參照本課題組之前的工作[18]。首先，將MWNTs進(jìn)行酸化處理，得到氧化多壁碳納米管(o-MWNTs)。將一定量的o-MWNTs和氧化石墨烯(GO)超聲溶解于水中，隨后加入鉬酸鈉和硫脲的混合溶液，攪拌1 h。將該溶液轉(zhuǎn)移至水熱合成反應(yīng)釜中，并在210 ℃的電烘箱中放置24 h，取出自然冷卻至室溫，進(jìn)行離心洗滌、凍干備用。為使金納米粒子修飾在MoS2/GO/o-MWNTs表面，稱取一定量MoS2/GO/o-MWNTs，超聲溶解于水中后，快速加入0.5 mmol/L HAuCl4溶液，震蕩混勻，靜置30 min后得到Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復(fù)合物。

1.3 Ru complex修飾鏈霉親和素(SA-Ru)的制備

SA-Ru的合成制備參照Deiss[19]的方法稍作修改：首先，將1 mg鏈霉親和素(SA)溶解在1 mL水中，取該溶液100 μL加入810 μL水和90 μL PBS(pH 7.4)混合均勻，隨后加入Ru complex的DMSO溶液100 μL(質(zhì)量濃度為1 g/mL)，4 ℃下連續(xù)攪拌4 h。最后，將混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中(截流分子量為10 000，透析液為PBS)透析16 h，每隔3 h換透析液。透析結(jié)束后，取出溶液，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝

電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝過程如圖1所示。在預(yù)先處理干凈的玻碳電極(GCE)表面滴涂10.0 μL AMGMs納米復(fù)合物，室溫自然干燥，使其形成一層均勻致密的薄膜。隨后將10 μL Ab1(12.0 μg/mL)滴加至電極表面，冰箱內(nèi)孵育過夜后，用PBS洗滌，并用BSA封閉液孵育1 h。37 ℃下，將不同濃度的PSA底液滴至上述修飾電極表面，恒溫孵育1 h以捕獲大量PSA。再次洗滌后，將10 μL Ab2-B(10.0 μg/mL)滴至上述電極表面，37 ℃下孵育1 h，以結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)。最后，在上述電極表面滴加SA-Ru 溶液，37 ℃孵育30 min，利用生物素與親和素之間的特異性親和作用，將SA-Ru組裝至電極表面。采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)交流阻抗法研究傳感器的組裝過程，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測不同PSA濃度下傳感器的發(fā)光信號，從而實(shí)現(xiàn)PSA的定量檢測。

圖1 用于檢測 PSA的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器構(gòu)建示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備與表征

采用FESEM和TEM對合成的三維花狀A(yù)u@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復(fù)合材料(AMGMs)的形貌進(jìn)行了表征(圖2A、2B)?？捎^察到AMGMs呈現(xiàn)三維花瓣?duì)畹那蛐徒Y(jié)構(gòu)，粒徑范圍為0.8～1.0 μm,在其花瓣上均勻分布有粒徑約為5～10 nm的金納米粒子。上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象均表明AMGMs納米復(fù)合材料已成功制備。隨后，將AMGMs作為納米基底固載Ab1，利用三明治免疫反應(yīng)將修飾生物素的二抗(Ab2-B)組裝至電極表面，最后利用生物素與親和素之間的特異性作用，將修飾Ru complex的親和素(SA-Ru)固定在電極表面。

采用電化學(xué)循環(huán)伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)對上述電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝過程進(jìn)行跟蹤表征。如圖2 C所示，裸GCE(曲線a)的CV曲線呈現(xiàn)出一對可逆的氧化還原峰，其峰電位差為0.08 V，是單純的Fe2+/Fe3+在電極上轉(zhuǎn)移電子所產(chǎn)生；當(dāng)在其表面修飾AMGMs納米復(fù)合材料后(曲線 b)，這對氧化還原峰電流減弱，峰電位差增加，這是因?yàn)锳MGMs在電極表面形成了一層光滑致密的薄膜，致使電極界面處的電子轉(zhuǎn)移受到阻礙。當(dāng)進(jìn)一步向電極表面修飾Ab1、BSA、PSA、Ab2-B、SA-Ru后，電極的氧化還原峰電流強(qiáng)度逐漸下降，峰電位差逐漸增加，直至氧化還原峰消失(曲線 c、d、e、f、g)，這是由于Ab1、BSA、PSA、Ab2-B和SA-Ru等均為非導(dǎo)電的蛋白質(zhì)大分子，這種蛋白的封閉作用導(dǎo)致電極界面電子傳遞被阻礙。實(shí)驗(yàn)表明傳感器已成功組裝。

圖2 AMGMs的FESEM(A)及TEM(B)圖，電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器組裝過程的CV(C)及EIS(D)圖

電化學(xué)交流阻抗譜(EIS)也常被用作表征電極界面情況的手段之一[20]，其圖譜中的高頻區(qū)半圓直徑值為電極表面電荷轉(zhuǎn)移電阻的大小，常用Ret表示。圖2D為傳感器在不同組裝過程中的電化學(xué)阻抗譜圖。對于無任何修飾的GCE，圖譜顯示出近似直線的圖形(曲線a)，說明電極表面幾乎無阻礙電子傳遞的物質(zhì)。當(dāng)AMGMs在電極表面形成薄膜時,EIS半圓增加，Ret增大，說明納米復(fù)合材料所形成的薄膜阻礙了電子在電極表面的轉(zhuǎn)移(曲線b)。當(dāng)Ab1 和BSA 組裝至電極后，由于蛋白的加入導(dǎo)致電阻逐步增大(曲線c、d)，而當(dāng)PSA被Ab1所捕獲和加入Ab2-B形成三明治結(jié)構(gòu)后，電阻進(jìn)一步增大(曲線e、f)；最后引入SA-Ru，使阻抗再次增大(曲線g)。綜合CV和EIS的檢測結(jié)果，可看出每一步電極的修飾過程均是有效的，各物質(zhì)均成功地修飾到了電極表面。

圖3 SA-Ru/Ab2-B/BSA/Ab1/AMGMs/GCE(a),SA-Ru/Ab2-B/PSA/BSA/Ab1/AMGMs/GCE(b)及SA-Ru/Ab2-B/PSA/BSA/Ab1/GCE(c)在含有10 mmol/L TPrA 的PBS溶液中的ECL圖

2.2 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的可行性分析

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于PSA檢測的可行性，采用電化學(xué)發(fā)光法在PBS緩沖液中對傳感器進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)組裝過程中未滴加PSA時，傳感器未檢出任何發(fā)光信號(曲線a)，這是由于缺乏PSA時，三明治結(jié)構(gòu)無法構(gòu)建，從而導(dǎo)致Ab2-B和SA-Ru無法組裝到電極表面，因此未檢出Ru的發(fā)光信號。當(dāng)組裝過程中滴加了50 ng/mL PSA后，傳感器檢測到很強(qiáng)的ECL信號，且發(fā)光強(qiáng)度達(dá)4 483 a.u.(曲線c)，這說明在PSA存在下，SA-Ru被成功地組裝到電極表面，并產(chǎn)生強(qiáng)而穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光信號，充分證明通過檢測電極上Ru的發(fā)光強(qiáng)度來確定PSA濃度是可行的。

為了證實(shí)AMGMs納米復(fù)合材料在電化學(xué)發(fā)光免疫體系中的信號放大作用，本文進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3b所示。當(dāng)將Ab1、BSA、PSA、Ab2-B和SA-Ru直接組裝到裸玻碳電極上后，雖然可檢出電化學(xué)發(fā)光信號，但信號非常弱，發(fā)光強(qiáng)度僅為1 280 a.u.，這說明以AMGMs作為固定化基底，不僅可增大電極的比表面積，使Ab1的負(fù)載量成倍增加，而且由于其優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物相容性，能夠最大程度地保持抗體活性，增加電子轉(zhuǎn)移速率，具有很強(qiáng)的信號放大作用。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了有效地將所構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器應(yīng)用于PSA檢測，本文對相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

抗體濃度是決定傳感器性能的重要因素，因此，本實(shí)驗(yàn)分別對Ab1和Ab2-B的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。如圖4A所示，ECL強(qiáng)度隨著Ab1質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)Ab1質(zhì)量濃度超過12.0 μg/mL 后，ECL強(qiáng)度達(dá)到最大，繼續(xù)增大Ab1質(zhì)量濃度，ECL則持續(xù)下降，這可能是由于電極表面區(qū)域限制了抗體的負(fù)載。此外，過飽和的負(fù)載量還會影響抗體的有效利用率，所以本實(shí)驗(yàn)選用質(zhì)量濃度為12.0 μg/mL的Ab1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同理，抗體Ab2-B的質(zhì)量濃度在5.0～10.0 μg/mL時，ECL呈上升趨勢，且在10.0 μg/mL處，ECL出現(xiàn)最大點(diǎn)，之后開始下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10.0 μg/mL作為Ab2-B的最佳濃度。

AMGMs在電極表面的滴涂量也是影響ECL免疫傳感器性能的顯著因素。圖4B為AMGMs用量的優(yōu)化曲線，可以看出當(dāng)AMGMs體積從2.0 μL增加到10.0 μL時，ECL發(fā)光信號逐漸增加，當(dāng)體積大于10.0 μL后，發(fā)光信號下降。這是由于AMGMs能夠有效增加電極的比表面積，提高電子轉(zhuǎn)移速率，但電極上過量的AMGMs會導(dǎo)致ECL背景信號的增加以及電子轉(zhuǎn)移速率的降低。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇10.0 μL AMGMs為最佳用量。

圖4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖5 不同質(zhì)量濃度PSA的ECL響應(yīng)曲線

2.4 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的性能分析

在上述優(yōu)化條件下，利用所制備的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器對不同質(zhì)量濃度的PSA進(jìn)行定量檢測，結(jié)果如圖5所示。隨著PSA質(zhì)量濃度的增大(從0.1 pg/mL 到50 ng/mL)，ECL響應(yīng)逐漸增大。在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ECL的響應(yīng)數(shù)值與logc呈良好的線性關(guān)系，線性擬合方程為IECL=507.63 logc+3 167.6，檢出限(S/N=3)為0.1 pg/mL。上述結(jié)果表明，該電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器能夠有效地實(shí)現(xiàn)PSA的靈敏檢測。與國內(nèi)外其它文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果相比，該法得到的檢出限更低[21-23]，在臨床診斷與治療中具有更大的實(shí)用性。

為了考察該免疫傳感器對PSA的特異性，選取幾種干擾因子如BSA、 EB病毒核抗原1(EBNA-1)和EB病毒衍生的潛伏膜蛋白1(LMP-1)對其進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，在檢測體系中加入上述物質(zhì)以考察傳感器的抗干擾能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述干擾因子存在的情況下，檢測結(jié)果幾乎未改變，說明上述物質(zhì)對PSA的干擾可忽略不計(jì)，表明該傳感器具有較高的特異性。

為了考察該傳感器的重現(xiàn)性，在相同條件下，對50 ng/mL的PSA進(jìn)行連續(xù)多次檢測。所測的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.2%和4.3%，顯示該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。穩(wěn)定性也是免疫傳感器的一個重要指標(biāo)。將制備好的傳感器放置在PBS(pH 7.4)中，4 ℃保存，30 d后檢測其 ECL信號。發(fā)現(xiàn)ECL強(qiáng)度仍可保留初始強(qiáng)度的90%，說明構(gòu)建的傳感器具備優(yōu)異的穩(wěn)定性。

2.5 實(shí)際樣品的檢測

為了檢驗(yàn)該傳感器在實(shí)際樣品分析中的準(zhǔn)確性與實(shí)用性，本實(shí)驗(yàn)采用制備好的傳感器用于檢測成年男性血清樣本中的PSA濃度，并通過測定質(zhì)量濃度分別為10、30、50 ng/mL PSA抗原的回收率來研究人血清樣品中的PSA活性，每組至少檢測3次。結(jié)果表明，PSA抗原的回收率為98.2%～106%，說明該方法對人血清樣本中PSA抗原的檢測具有良好的準(zhǔn)確性，該方法具有較好的臨床應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本文利用水熱法和原位還原法合成出三維花狀的Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復(fù)合物(AMGMs)，并將其作為一種理想的固定化基底，構(gòu)筑了高靈敏的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，用于檢測前列腺特異性抗原(PSA)。當(dāng)?shù)滓褐写嬖赑SA時，修飾生物素的二抗(Ab2-B)可以通過三明治免疫反應(yīng)組裝到電極表面，隨后，再利用生物素與親和素之間的特異性作用，將修飾Ru complex的親和素固定于電極上，通過測定Ru的電化學(xué)發(fā)光信號，定量檢測底液中的PSA濃度。該傳感體系不僅線性范圍寬，檢出限低，還具有結(jié)構(gòu)簡單、特異性好、無污染等優(yōu)點(diǎn)。此外，通過改變特異性抗體，該體系可以擴(kuò)展到檢測其他疾病標(biāo)志物，這意味著所構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器在疾病的早期診斷和分析中將展現(xiàn)巨大的應(yīng)用前景。