湯 娟，費曉慶，富 薇，周 佳，丁友超，錢 凱，董紹偉，曹麗華

(1.南京海關工業(yè)產(chǎn)品檢測中心，江蘇 南京 210019；2.南京海關動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019；3.中國合格評定國家認可中心，北京 100062；4.南京金檢檢驗有限公司，江蘇 南京 210019)

根據(jù)心理學研究分析，人類通過感覺接受的外界信息主要來自于視覺，其中顏色尤其是鮮艷的顏色尤為重要，因此在牙膏和漱口水的生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)者會通過加入染料來吸引更多消費者。牙膏中常見的染料有二氧化鈦(Cl 77891)、酸性紅33(Cl 17200)、檸檬黃(Cl 19140)、亮藍(Cl 42090)、顏料綠7(Cl 74260)等，漱口水中常見的染料有亮藍、檸檬黃、胭脂紅等。染料可分為天然染料和合成染料，目前已知的染料有七千多種，牙膏和漱口水中常見染料以合成染料為主。然而，隨著合成染料的大量使用和科學技術的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)一些合成染料對人、動物、植物和環(huán)境會造成不可逆的損傷，如：酸性紅26、直接紅28和分散藍1等染料含有芳香胺結構，具有直接致癌誘變性；堿性紅9與男性膀胱癌的發(fā)生有關聯(lián)，對哺乳動物還可誘發(fā)肝癌、甲狀腺癌、乳腺癌和淋巴癌等[1]。我國《化妝品監(jiān)督管理條例》[2]規(guī)定將牙膏參照普通化妝品的相關要求進行管理，《化妝品安全技術規(guī)范》[3]中明確將分散藍1、分散黃3、堿性紅9、堿性紫3、直接黑38、直接藍6、直接棕95、直接紅28、溶劑黃1、溶劑黃3、酸性紫49、分散橙149等致癌染料列為禁用染料，但該技術法規(guī)未包含所有禁用致癌染料。

此外，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)將酸性紅26、酸性紅114、直接藍15、堿性紫14等染料列入2B類致癌物清單[4]中；歐盟化學品管理局(ECHA)公布的高關注度物質(zhì)(SVHC)清單[5]中將堿性藍26等染料的屬性定為致癌；ISO 16373-2：2014[6]將分散橙11、溶劑黃2等歸類為致癌染料；服裝及鞋襪國際物質(zhì)限用清單管理工作組(AFIRM-RSL)[7]將分散黃23、分散黃56、分散黃7、分散紅151列為禁用染料。綜上，建立靈敏、有效的測定牙膏和漱口水中多種致癌染料的分析方法具有重要意義和實用價值。

目前針對致癌染料檢測的基質(zhì)集中于紡織品[8-9]、皮革[10]、染料產(chǎn)品[11-12]、塑料制品[13]和玩具[14-15]等，檢測方法主要有液相色譜法(LC)[16-17]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[18-20]，但與牙膏和漱口水相關的研究較為缺乏。LC-MS法與LC法相比雖具有更高的靈敏度，但牙膏中的表面活性劑和增稠劑會對質(zhì)譜造成嚴重污染?；谇拔奶峒暗母鞣N法規(guī)和清單，本文采用高效液相色譜法對牙膏和漱口水中的23種致癌染料進行測定，目標化合物個數(shù)遠高于文獻報道。本方法可為牙膏和漱口水的品質(zhì)安全監(jiān)管提供技術支持，具有較高的應用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1260型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器(DAD，美國Agilent公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q去離子發(fā)生器(美國Sigma公司)；T215/IPC 250-3真空干燥器(上海領德儀器有限公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；PL602-L和ML54型電子天平(感量0.01 g和0.000 1 g，梅特勒-托利多上海有限公司)。

甲醇、乙腈和乙醇(色譜純，德國Merck公司)；色譜純乙酸銨、0.5 mol/L磷酸二氫四丁基銨(美國Sigma-Aldrich公司)；70%～75%乙酸二正己基銨、0.5 mol/L四丁基氟化銨(日本TCI公司)；石英砂(分析純，南京化學試劑股份有限公司)。

標準品：堿性紅9(78.3%，純度，下同)、堿性紫14(30.0%)、分散藍1(73.0%)、直接藍6(58.2%)、直接藍15(87.5%)、酸性紅26(81.0%)、直接紅28(78.8%)、溶劑黃1(97.6%)、酸性紫49(99.8%)、直接棕95(80.5%)、分散橙11(96.7%)、直接黑38(52.0%)、堿性紫3(84.9%)、分散黃56(88.4%)、分散黃3(98.7%)、酸性紅114(92.3%)、溶劑黃3(98.5%)、溶劑黃2(98.7%)、堿性藍26(96.5%)、分散黃23(97.8%)、分散橙149(95.8%)、分散黃7(94.3%)、分散紅151(98.4%)均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

實際樣品：239個牙膏樣品和88個漱口水樣品均由南京海關工業(yè)產(chǎn)品檢測中心提供。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液：根據(jù)各標準品純度換算，分別準確稱取一定量的23種致癌染料標準品，分別用乙醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的單一標準儲備液，于4 ℃冷藏保存。

標準工作溶液：分別移取一定體積上述標準儲備溶液，配制成混合標準溶液(分散藍1、直接藍6、直接藍15、直接棕95、分散橙11、直接黑38和分散黃56的質(zhì)量濃度為200 mg/L；堿性紅9、酸性紅26、直接紅28和酸性紅114的質(zhì)量濃度為100 mg/L；堿性紫14、溶劑黃1、分散黃3、溶劑黃2、堿性藍26、分散橙149、分散黃7和分散紅151的質(zhì)量濃度為50 mg/L；酸性紫49、堿性紫3、溶劑黃3和分散黃23的質(zhì)量濃度為20 mg/L )，根據(jù)需要用乙醇稀釋配制成系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 漱口水稱取1.0 g(精確至0.01 g)樣品，置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，混勻，取部分樣品待測。

1.3.2 牙膏稱取1.0 g(精確至0.01 g)樣品，置于50 mL離心管中，加入適量水和石英砂，渦旋混合均勻，置于真空干燥器中75 ℃烘干后，加入10 mL乙醇，50 ℃超聲30 min，以8 000 r/min離心3 min后，取部分上清液待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A為2.5 mmol/L磷酸二氫四丁基銨水溶液(pH 7.5)，B為甲醇-乙腈(體積比50∶50)。梯度洗脫程序：0.0～15.0 min，15%～40%B；15.0～17.0 min，40%B；17.0～32.0 min，40%～85%B。流速：1.5 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：400、500、600 nm。

2 結果與討論

2.1 混合標準溶液分組

配制染料混合標準溶液時，應考慮色譜分離、陰離子和陽離子化合物不能混合以及標準品互含等情況，需將混合標準溶液進行分組配制[21]。本實驗配制了23種致癌染料的混合標準溶液(質(zhì)量濃度見“1.2”)，于配制當天與各物質(zhì)相同濃度單標溶液的色譜行為進行比較，之后將混合標準溶液與單標溶液于4 ℃下避光保存，分別于第7、14、21、28、35 d對上述標準溶液進行測定。結果表明，混合標準溶液中23種致癌染料的保留時間與單標一致，各組分的峰面積基本相當，不同儲存時間下混合標準溶液中23種致癌染料的峰面積與單標溶液峰面積的比值為92.5%～102%，因此推測所配制的混合標準溶液可在4 ℃下避光保存35 d。

2.2 色譜柱的選擇

色譜柱是色譜分離體系的心臟，因此對色譜柱進行了選擇。由于反相色譜柱柱效高，分離能力強，保留機理清楚，在液相色譜分離模式中應用最為廣泛，本實驗比較了2種常用反相色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)和苯基柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)對23種致癌染料的分離效果。結果顯示，大部分待測物在C18柱上能夠得到有效分離，但酸性紫49和直接棕95的分離效果不佳，而23種待測物在苯基柱上均能達到有效分離。因此，本研究最終選擇苯基柱為分析色譜柱。

2.3 流動相的優(yōu)化

23種致癌染料中包含多種以陰離子形式存在的化合物，如以水作為水相流動相，由于大分子結構空間位阻，使得這些致癌染料在反相色譜柱上保留較差甚至無保留。陽離子對試劑可增加陰離子型化合物與固定相的結合力，因此實驗比較了帶不同大小基團的陽離子對試劑(乙酸銨、乙酸二正己基銨、四丁基氟化銨和磷酸二氫四丁基銨)對23種致癌染料保留的影響，水溶液濃度均為2.5 mmol/L。結果表明，隨著離子對試劑所帶基團的增大，陰離子型致癌染料的保留隨之增強，其中乙酸銨的效果最小，磷酸二氫四丁基銨的效果最明顯，且不影響其它類型致癌染料的分離。

此外，考察了水相流動相的pH值對23種致癌染料色譜分離的影響，結果顯示，當pH值為7.0～8.0時，23種待測組分均有較高的響應和較好的色譜峰形，因此選擇pH 7.5的水相流動相。實驗考察了分別以甲醇和乙腈作為有機流動相時的分離效果，結果表明乙腈不能使23種致癌染料得到有效分離，而采用甲醇時23種致癌染料的分析時間較長，峰形較差。并且由于甲醇和乙腈對23種致癌染料的洗脫能力不同，導致一些染料的出峰順序發(fā)生改變。進一步比較了不同比例的甲醇-乙腈混合溶液作為有機流動相對待測物分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈(體積比50∶50)的分離效果最佳，因此選擇2.5 mmol/L磷酸二氫四丁基銨水溶液(pH 7.5)和甲醇-乙腈(體積比50∶50)為流動相。優(yōu)化色譜條件下，23種致癌染料混合標準溶液的液相色譜圖見圖1，可在32 min內(nèi)完成色譜分離。

圖1 23種致癌染料混合標準溶液的液相色譜圖

2.4 紫外檢測波長的選擇

采用三維(3D)檢測模式，分別對23種致癌染料的單標溶液在190～800 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，得到23種致癌染料的最大吸收波長。結合檢測靈敏度及工作效率，本實驗采用400 nm、500 nm和600 nm對23種致癌染料進行掃描測定。

2.5 前處理條件的優(yōu)化

2.5.1 烘干條件的優(yōu)化牙膏中含有羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、鹿角果膠或黃原膠等增稠劑，這些增稠劑易溶于水，不溶于純有機溶劑。牙膏中還含大量水分，如直接用有機試劑提取，部分增稠劑會溶于有機試劑與水的混合液中，導致進樣溶液嚴重堵塞色譜柱，因此需對樣品進行烘干處理。樣品烘干前加入適量石英砂混勻，可增加樣品與空氣的接觸面，縮短烘干時間，也可防止樣品烘干后結塊影響提取。樣品水分的常用烘干溫度為75 ℃和105 ℃，經(jīng)試驗可知，采用普通烘箱105 ℃烘干時，直接藍15等不穩(wěn)定染料會分解;當烘干溫度為75 ℃，烘干時間較長，影響工作效率。真空干燥器可在真空狀態(tài)下降低水的沸點，適用于熱敏性物質(zhì)的干燥，因此，本實驗采用真空干燥器75 ℃烘干牙膏樣品。

2.5.2 超聲條件的優(yōu)化23種致癌染料的極性分布較寬，其中直接黑38、直接藍6、直接藍15、直接棕95、直接紅28等離子型致癌染料不溶于多數(shù)有機溶劑，但在乙醇中有較好的溶解性，因此選擇乙醇作為提取溶劑。本實驗采用超聲萃取對牙膏樣品進行提取，升高超聲溫度、延長超聲時間和提高超聲頻率均能促進化合物的溶出和溶解，但溫度過高會使不穩(wěn)定化合物分解，超聲時間過長會影響工作效率，超聲頻率過高會導致化合物結構發(fā)生變化。分別考察了在不同的超聲溫度(30、40、50、60 ℃)、超聲時間(10、20、30、40 min)和超聲頻率(84、168、252、336、420 W)下，乙醇對同一自制陽性牙膏樣品(待測組分的添加量均為100 mg/kg)的提取情況，結果見表1。由表1可知，當超聲溫度為50 ℃、超聲時間為30 min和超聲頻率為252 W時，23種致癌染料的提取總量達最大值。因此，牙膏樣品采用超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min和超聲頻率252 W為前處理條件。

表1 不同超聲溫度、超聲時間和超聲頻率下23種致癌染料的提取總量

2.6 方法學評價

2.6.1 線性范圍、檢出限與定量下限將“1.2”的混合標準溶液用乙醇逐級稀釋，采用本方法進行測定，以各組分的峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x，mg·L-1)進行線性回歸，得到線性回歸方程。結果表明，23種致癌染料在對應的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)(r2)均不小于0.999 1。在陰性樣品中添加不同濃度的待測組分，根據(jù)3倍和10倍信噪比分別計算檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)，得到23種致癌染料的LOD為0.06～0.66 mg/L，LOQ為0.18～1.98 mg/L(見表2)，能夠滿足目前的檢測要求。

表2 23種致癌染料的保留時間、檢測波長、線性關系、檢出限與定量下限

2.6.2 回收率及相對標準偏差以陰性牙膏和漱口水樣品為基質(zhì)，分別進行3個不同加標水平的回收實驗，每個加標水平作6次平行，按照“1.3”進行樣品前處理，在“1.4”色譜條件下測定，計算得到23種致癌染料的平均回收率和相對標準偏差(RSD)。由表3可知，23種致癌染料在牙膏和漱口水中的平均回收率分別為91.2%～104%和92.0%～103%，RSD分別為2.5%～5.8%和2.3%～5.5%，表明該方法準確度好、精密度高，適用于牙膏和漱口水中致癌染料的測定。

表3 陰性樣品中23種致癌染料的回收率及相對標準偏差(n=6)

圖2 陽性樣品的色譜圖

2.7 實際樣品檢測

應用本方法分別對239個牙膏和88個漱口水樣品進行測定，其中1個牙膏樣品檢出堿性紫3，含量為53.4 mg/kg，色譜圖見圖2。

3 結 論

本文建立了高效液相色譜測定牙膏和漱口水中23種致癌染料的方法，并對色譜檢測條件和牙膏樣品前處理方法進行了優(yōu)化。結果表明，該方法操作簡單，線性關系良好，重復性好，具有較高的準確度和靈敏度，適用于各種牙膏和漱口水中致癌染料的檢測，能夠滿足國內(nèi)外對致癌染料殘留限量的要求。