洪正善 ，王元霞，楊 柯 ，曾春暉△

1 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；2 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院

金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是造成社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的常見病原菌，是導致人血液感染的主要原因，可感染各種器官從而引起感染性心內(nèi)膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等［1］。SA 還能躲避宿主的免疫系統(tǒng)，對抗生素產(chǎn)生耐藥性，影響療效［2］。

細菌通過對環(huán)境中信號分子的感應而進行的一系列基因調(diào)控現(xiàn)象，稱為群體效應（quorum sensing，QS），也稱為自誘導［3］。細菌之間通過某些自身分泌的次級代謝產(chǎn)物作為信號分子，在細菌達到某個閾濃度時通過對這些信號分子的識別而產(chǎn)生一些基因表達，從而產(chǎn)生一系列生理變化［4］。目前認為 SA 內(nèi)有兩種 QS 系統(tǒng)——Agr 和LuxS/AI-2 系統(tǒng) ，且這兩個 QS 系統(tǒng)與 SA 的毒性和耐藥性密切相關(guān)［5］。

藤茶［Ampelopsi grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang］系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的嫩莖葉［6］。其化學成分主要是黃酮類化合物，而雙氫楊梅樹皮素（ampelopsim，APS）、楊梅樹皮素及蛇葡萄素被認為是其中的主要活性成分［6］。前期研究［7］發(fā)現(xiàn)APS對SA、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌等均有極高的抗菌活性，APS可不同程度損害耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）、SA 的細胞壁、細胞膜，漏出胞漿內(nèi)容物，改變細菌形態(tài)［8］。

因此，本實驗通過觀察APS對標準SA NTCC8325及其QS 調(diào)控基因agrA 和luxS 缺失株腹腔感染小鼠的保護作用，研究藤茶提取物APS 通過QS 系統(tǒng)減少SA感染的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株標準金黃色葡萄球菌NTCC8325標準株購于江蘇晶美生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌NTCC8325 的agrA 基因缺失株NTCC8325△agrA 和 luxS 基因缺失株 NTCC8325△luxS 由中國科技大學孫寶林教授提供。

1.2 主要藥物和試劑APS 由廣西中醫(yī)藥大學中藥化學教研室提供，從藤茶莖葉中分離、純化得到，為灰白色粉末，純度≥98%，結(jié)構(gòu)式如下：

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（天津市富宇精細化工有限公司，批號：20171105）；氯化三苯四氮唑（2，3，5-tripheny-ltetrazolium chloride，TTC；中國華東師范大學化工廠，批號：20101026）；水解酪蛋白胨（mueller-hintonbroth，MH）肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：3105299）；胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB；廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：310445）；營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責任公司，批號：100689）；結(jié)晶紫試劑（西隴化工股份有限公司，批號：140115）。

1.3 主要儀器SW-CJ-1F 型潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HVE-50 型高壓滅菌鍋（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；CDUPT 型純水儀（成都越純科技有限公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；Mini-15K 型高速離心機（杭州奧盛儀器有限公司）；ST-360 型全波長酶標儀（Epoch Biotek 公司，美國）；JJ200 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；722N 型紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；XW-80A 型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Sysmex XT-2000i全自動血液分析儀（日本）。

1.4 實驗動物昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼半，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCVK（湘）2016-0002，實驗動物合格證號：43004700040127。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌液配制 將標準SA NTCC8325 及agrA基因缺失株NTCC8325△agrA 接種在營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜（≈12 h）。挑取活化后的單菌落接種于10 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜。

1.5.2 藥物配置 每1 mg的APS加50 μL的DMSO助溶，之后用生理鹽水稀釋到所需濃度，再用0.22 μm的針式過濾器過濾除菌備用。

1.5.3 SA標準株及agrA基因缺失株的生長曲線制作 分別吸取活化的SA NTCC8325、NTCC8325△agrA和NTCC8325△luxS菌懸液50 μL至新鮮10 mL TSB 培養(yǎng)液混勻繼續(xù)培養(yǎng)。分別于混勻后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h 測A600值，同時測3次取平均值。將所得數(shù)據(jù)以時間為橫坐標，A600值為縱坐標作圖，得其生長曲線圖，比較相鄰時間點A600值的差值，得到細菌活力最強的時間點。

1.5.4 小鼠腹腔感染模型和灌胃給藥 取130只昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分為空白組、NTCC8325模型組、NTCC8325△agrA模型組、NTCC8325△luxS模型組及 NTCC8325 APS、NTCC8325 △agrA APS、NTCC8325△-luxSAPS高（200mg/kg）、中（100mg/kg）、低（50 mg/kg）劑量組。小鼠預先灌胃給藥，空白組及各模型組灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)7天，給藥容量為20 mL/kg，第7 天灌胃1 h 后，每只小鼠腹腔注射培養(yǎng)至活力最強的受試菌0.5 mL（空白組注射無菌生理鹽水）。

1.5.5 腹腔液活菌計數(shù) 造模4 h 后，無菌環(huán)境下眼球取血，然后頸椎脫臼處死小鼠，向小鼠腹腔注射5 mL 預冷的無菌PBS，抖動小鼠腹部使腹腔內(nèi)白細胞充分游離，2 min 后小心吸取腹腔內(nèi)液體，按等比稀釋法稀釋成 1×10-2、1×10-4、1×10-6倍數(shù)，分別于營養(yǎng)瓊脂平板上涂布100 μL 稀釋液，重復 3 次，37℃培養(yǎng) 24 h 后，選取菌落數(shù) 30～300 之間的培養(yǎng)皿，計算每毫升中菌落形成單位（cfu）。cfu=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。

1.5.6 感染小鼠血液白細胞分類計數(shù) 造模4 h后，小鼠眼球取血，在血液凝結(jié)前吸取100 μL 至裝有100 μL 20 U/mL 肝素鈉溶液中，充分混勻避免血凝塊，進行白細胞分類計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SA 標準株及agrA 基因缺失株的生長曲線NTCC8325 菌株在 10～12 h 之間OD 值增加最大，生長最快；NTCC8325△agrA 菌株在 12～14 h之間OD 值增加最大，生長最快；NTCC8325△luxS菌株在12～14 h 之間OD 值增加最大，生長最快。見圖1、表1。

圖1 SA NTCC8325、NTCC8325△agrA和NTCC8325△luxS的生長曲線

表1 菌液培養(yǎng)不同時間的OD值

NTCC8325 菌株 10～12 h OD 值從 0.145 增加到 0.457，增加了 0.209 個 OD 值；NTCC8325△agrA菌株 12～14 h OD 值從 0.247 增加到 0.461，增加了 0.214 個 OD 值。因此 ，11 h 左右 NTCC8325 的 OD值在0.145～0.457之間，此時菌株活力最強；13 h左右 NTCC8325△agrA 的 OD 值在 0.247～0.461 之間，此時菌株活力最強；13 h左右NTCC8325△luxS的OD值在0.248～0.468之間，此時菌株活力最強。

2.2 腹腔活菌數(shù)造模4 h 后，模型組小鼠腹腔液中的活菌數(shù)高于空白組（P＜0.01）；高劑量APS能減少NTCC8325 腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.05），減少 NTCC8325△agrA 和 NTCC8325△luxS腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.01）；中劑量APS 能減少NTCC8325 和NTCC8325△luxS腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.05），減少NTCC8325△agrA 腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.01）；低劑量APS 能減少NTCC8325△agrA腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.05），能減少NTCC8325△luxS腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.01）。高劑量APS灌胃后，NTCC8325△agrA和NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)少于NTCC8325 腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.05）；中劑量APS灌胃后，NTCC8325△luxS腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)少于NTCC8325腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.05）；低劑量APS 灌胃后，NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)少于NTCC8325 腹腔感染小鼠腹腔液中的活菌數(shù)（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腹腔液中活菌計數(shù)（）

表2 各組小鼠腹腔液中活菌計數(shù)（）

注：與空白組比較，*表示P＜0.01；與同菌種的模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；同一劑量組內(nèi)與NTCC8325 組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

劑量（mg/kg）CFU（×105/mL）0.02±0.01 2.00±0.40*1.19±0.15*△1.96±0.29*1.12±0.49#1.12±0.16△0.82±0.11##△1.33±0.23##1.10±0.26 0.89±0.11##△1.59±0.03 0.93±0.14#1.03±0.17##△組別空白組鼠數(shù)10模型組10- -高劑量組10200中劑量組10100低劑量組NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS 1050

2.3 小鼠腹腔白細胞分類計數(shù)

2.3.1 白細胞計數(shù) 造模4 h，模型組白細胞（white blood cell，WBC）數(shù)高于空白組（P＜0.01）；與同菌種的模型組比較，高劑量APS 能減少NTCC8325 和NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠血液中的白細胞（P＜0.01），能降低NTCC8325 腹腔感染小鼠血液中的白細胞（P＜0.05）；中劑量APS 能減少NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠血液中的白細胞（P＜0.01），能降低NTCC8325 腹腔感染小鼠血液中的白細胞（P＜0.05）；低劑量APS 能減少NTCC8325（P＜0.05）。與同一劑量NTCC8325組比較，模型組NTCC8325△agrA 腹腔感染小鼠血液中的白細胞數(shù)低于NTCC8325 腹腔感染小鼠血液中的白細胞數(shù)（P＜0.01）；高劑量組中NTCC8325△agrA腹腔感染小鼠血液中的白細胞數(shù)低于NTCC8325腹腔感染小鼠血液中的白細胞數(shù)（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腹腔液中白細胞計數(shù)（）

表3 各組小鼠腹腔液中白細胞計數(shù)（）

注：與空白組比較，*表示P＜0.01；與同菌種的模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；同一劑量組內(nèi)與NTCC8325 組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

劑量（mg/kg）組別空白組鼠數(shù)10 10- -模型組高劑量組NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS 200 10 10中劑量組100 50低劑量組WBC 2.02±0.44 4.63±0.36*3.61±0.37*△△4.69±0.43*3.65±0.63##2.94±0.73#△3.60±0.77##3.79±0.76#3.46±0.88 3.69±0.73##3.77±0.62#3.35±0.92 3.89±0.82#10

2.3.2 中性粒細胞計數(shù) 造模4 h，模型組中性粒細胞（neutrophil，NEUT）數(shù)高于空白組（P＜0.01）；與同菌種模型組比較，高劑量APS 能減少NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠血液中的中性粒細胞（P＜0.01），能降低NTCC8325 腹腔感染小鼠血液中的中性粒細胞（P＜0.05）；中劑量APS能減少NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠血液中的中性粒細胞（P＜0.05）。與同一劑量的NTCC8325組比較，各菌種組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠腹腔液中中性粒細胞計數(shù)（）

表4 各組小鼠腹腔液中中性粒細胞計數(shù)（）

注：與空白組比較，*表示P＜0.01；與同菌種的模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；同一劑量組內(nèi)與NTCC8325組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

NEUT 1.35±0.19 1.97±0.39*1.86±0.42*2.10±0.29*1.40±0.40#1.50±0.47 1.31±0.48##1.49±0.34 1.58±0.61 1.63±0.18##1.73±0.41 1.66±0.41 1.68±0.33組別空白組鼠數(shù)10劑量（mg/kg）模型組10- -高劑量組10200中劑量組10100低劑量組NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS 1050

2.3.3 單核巨噬細胞計數(shù) 造模4 h，模型組單核巨噬細胞（mononuclear macrophages，MONO）數(shù)高于空白組（P＜0.01）；與同菌種模型組比較，高劑量 APS 能減少 NTCC8325 和 NTCC8325△luxS 腹腔感染小鼠血液中的單核巨噬細胞（P＜0.05）。與同一劑量NTCC8325 組比較各菌種組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠腹腔液中單核巨噬細胞計數(shù)（）

表5 各組小鼠腹腔液中單核巨噬細胞計數(shù)（）

注：與空白組比較，*表示P＜0.01；與同菌種的模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；同一劑量組內(nèi)與NTCC8325 組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

MONO 0.34±0.06 0.70±0.23*0.53±0.09*0.56±0.18*0.46±0.10#0.42±0.07#0.49±0.25 0.51±0.15 0.66±0.11 0.44±0.15 0.56±0.21 0.56±0.21 0.48±0.05組別空白組鼠數(shù)10劑量（mg/kg）模型組10- -高劑量組10200中劑量組10100低劑量組NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS NTCC8325 NTCC8325△agrA NTCC8325△luxS 1050

3 討論

在SA 中，agr QS 系統(tǒng)是一個全局調(diào)控子，對葡萄球菌屬生物膜形成和許多外毒素的分泌有較大影響［9］，agr 基因座大小為 3.5 kb，由 RNAⅡ和RNAⅢ兩個不同的轉(zhuǎn)錄單位組成，他們分別由P2和 P3 啟動子激活［10］，在 QS 信號分子 AIPs 進入菌體內(nèi)時，通過磷酸化AgrA，并結(jié)合RNAⅡ上的P2啟動子區(qū)域和RNAⅢ上的P3 啟動子區(qū)域，一方面通過影響 P2 與 P3 中間區(qū)域上的 sar 結(jié)合點［11］，影響agr/sar雙組分系統(tǒng)調(diào)控的SA的生物被膜形成通路，另一方面通過sarA 和RNAⅢ的激活，促進α-溶血素、腸毒素、纖維原結(jié)合蛋白、中毒性休克綜合征毒素等外毒素的分泌［12］。lux QS 系統(tǒng)廣泛分布于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，是多種細菌共通的QS 效應系統(tǒng)，影響生物被膜形成、毒素產(chǎn)生、致病因子表達等一系列細菌行為［13］。在SA中，lux QS 系統(tǒng)通過影響KdpDE 二元信號系統(tǒng)參與調(diào)控莢膜多糖合成酶基因的轉(zhuǎn)錄［9］，同時通過影響icaR的轉(zhuǎn)錄水平減少SA生物被膜量［5］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在缺失QS 調(diào)控基因agrA 和luxS 后，SA 生長至活力最強期所需時間延后，同時對小鼠的感染能力減弱，這可能因為QS 系統(tǒng)缺失后，生物被膜增厚，生物被膜解離減少，導致SA的生長和傳播受到限制［14］，此時APS 作用在難以擴散的生物被膜中，與標準株比較，能極大程度殺滅體內(nèi)的細菌，減少體內(nèi)活菌量，從而減弱炎癥反應。同時，因為在SA中，lux系統(tǒng)的表達與細菌生長狀態(tài)呈依賴性，隨著菌落數(shù)增長，luxS 缺失株定殖作用更強，同時生物被膜的解離作用較弱，所以luxS 缺失株的生物被膜厚度可能并未增加太多，而此時luxS 缺失株的毒力因子分泌未受到明顯影響，導致其更容易被體內(nèi)免疫系統(tǒng)識別并吞噬，因此，luxS 缺失株感染小鼠體內(nèi)的活菌數(shù)較少，白細胞數(shù)較多，此時灌胃APS后，APS進一步減少活菌數(shù)，降低體內(nèi)白細胞數(shù)，減輕感染程度，說明APS 在體內(nèi)通過作用agr 系統(tǒng)產(chǎn)生抗SA 作用。而在agrA 缺失株中，生物被膜厚度增加，毒力因子分泌減少，感染力較弱，體內(nèi)免疫系統(tǒng)識別較少，因此，agrA 缺失株感染小鼠體內(nèi)活菌數(shù)較多，白細胞數(shù)較少；此時灌胃APS 后，APS 進一步減少活菌數(shù)，降低體內(nèi)白細胞數(shù)，減輕感染程度，說明APS 在體內(nèi)通過作用lux 系統(tǒng)產(chǎn)生抗SA 作用。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，給藥APS后，luxS缺失株感染小鼠體內(nèi)的活菌數(shù)減少的趨勢較agrA 缺失株感染小鼠體內(nèi)活菌數(shù)減少趨勢明顯，因此推測APS 在體內(nèi)通過直接影響agr系統(tǒng)及間接影響lux系統(tǒng)，從而協(xié)同產(chǎn)生抗SA作用。