范光亮 周云飛 張志龍

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高病死率的特點(diǎn)[1]。當(dāng)前，臨床上的治療手段通常為手術(shù)切除、放療和化療，也有應(yīng)用靶向治療[2]。然而，膠質(zhì)瘤的預(yù)后非常差，中位生存期僅10～15個(gè)月[3]，高級(jí)別膠質(zhì)瘤預(yù)后更差。導(dǎo)致膠質(zhì)瘤整體生存時(shí)間短、生活質(zhì)量低的潛在原因，一般認(rèn)為是膠質(zhì)瘤的惡性侵襲和遠(yuǎn)處遷移[4]。因此，尋找有效的預(yù)后標(biāo)志物有助于膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷，可以進(jìn)一步指導(dǎo)膠質(zhì)瘤的治療。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-3653 對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用[5]。本文探討miR-3653對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2017 年1 月至2019 年3 月手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織25 例，其中男15 例，女10 例；平均年齡（62.96±5.86）歲；WHO分級(jí)Ⅱ級(jí)3例，Ⅲ級(jí)13例，Ⅳ級(jí)9 例；所有病人術(shù)前均未行抗腫瘤治療，切除膠質(zhì)瘤及瘤旁2 cm處腦組織，放入液氮保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將TG905細(xì)胞從液氮中取出，37 ℃快速融化，置于含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%的融合度時(shí)，進(jìn)行傳代處理，培養(yǎng)3～4代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞融合度達(dá)到60%以上時(shí)，使用LipfectamineTM 2000（美國(guó)Invitrogen 公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染MiR-3653 mimic 質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC-MiR-3653 mimic質(zhì)粒，抑制對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC-MiR-3653 inhibitor質(zhì)粒，抑制組轉(zhuǎn)染MiR-3653 inhibitor 質(zhì)粒，miR-3653+ZEB2 過(guò)表達(dá)組同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-3653 mimic 和ZEB2 mimic質(zhì)粒。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá) 使用TRIzol 法提取膠質(zhì)瘤組織總RNA，使用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6和GAPDH 為內(nèi)參。U6 引物：正義鏈5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 義 鏈5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'；GAPDH 引物正義鏈5’-TGTAGTTGAGGTCAATGA AGGG-3'，反義鏈5'-ACATCGCTCA GA CACCATG-3'；miR-3653 引物 正 義 鏈5'-TCTCCCGAG AGACATATTT-3'，反義鏈5'-GATGAGAAGGTATGAATCA-3'。反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Premix 10 μl，H2O 8 μl，cDNA 1 μl，上下游引物個(gè)0.5 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt算法計(jì)算mRNA 表達(dá)量。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用RIPA 蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取。加入適當(dāng)?shù)腞IPA 裂解液，冰上收集細(xì)胞，每隔3 min 震蕩一次。12 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，收集上清液。使用SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育，加二抗室溫孵育1.5～2 h 后，進(jìn)行曝光處理。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析每個(gè)蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值之比，以其比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 使用Transwell 法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。用無(wú)血清培養(yǎng)基制備含有膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液，加入適當(dāng)細(xì)胞懸浮液到上室中。然后，將含10%胎牛血清的DMEM 加入到下室中。細(xì)胞孵育24 h后，使用結(jié)晶紫染色，并在倒置顯微鏡（200倍）下，對(duì)隨機(jī)5個(gè)視野區(qū)域進(jìn)行觀察，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。

1.7 膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的檢測(cè) 使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。將細(xì)胞接種到12孔中，待其全部長(zhǎng)滿，使用100 μl的槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS將劃掉細(xì)胞洗凈，同時(shí)加入無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。處理0、48 h 后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件分析；定量資料采用±s表示，行t檢驗(yàn)和單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織miR-3653 的表達(dá) 與瘤旁腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織miR-3653表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.05，圖1）。

圖2 miR-3653 過(guò)表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤TG905 細(xì)胞EMT 標(biāo)志分子mRNA表達(dá)的影響

2.2 過(guò)表達(dá)miR-3653 抑制TG905 細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組上皮型鈣黏蛋白mRNA 水平明顯升高（P＜0.05），而神經(jīng)型鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 miR-3653抑制膠質(zhì)瘤TG905細(xì)胞的侵襲和遷移能力 與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，miR-3653 過(guò)表達(dá)組miR-3653 水平顯著提高（P＜0.05，圖3A），明顯抑制TG905細(xì)胞的遷移和侵襲（P＜0.05，圖3B、3C）。與抑制對(duì)照組相比，miR-3653 抑制組miR-3653 水平顯著降低（P＜0.05，圖3D），明顯促進(jìn)TG905 細(xì)胞的遷移和侵襲（P＜0.05，圖3E、3F）。

圖3 miR-3653對(duì)膠質(zhì)瘤TG905細(xì)胞侵襲和遷移的影響

圖4 miR-3653對(duì)膠質(zhì)瘤TG905細(xì)胞ZEB2表達(dá)的影響

2.4 過(guò)表達(dá)miR-3653 抑制TG905 細(xì)胞ZEB2 表達(dá)與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組ZEB2表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05，圖4A、4B）。與抑制對(duì)照組相比，抑制組ZEB2表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05，圖4C、4D）。

圖5 過(guò)表達(dá)ZEB2抑制miR-3653對(duì)膠質(zhì)瘤TG905細(xì)胞的作用

2.5 過(guò)表達(dá)ZEB2 抑制miR-3653 對(duì)TG905 細(xì)胞的作用 與過(guò)表達(dá)組相比，miR-3653+ZEB2 過(guò)表達(dá)組上皮型鈣黏蛋白mRNA和蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖5A、5B），而神經(jīng)型鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA和蛋白水平明顯增高（P＜0.05，圖5A、5B），TG905 細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著增加（P＜0.05，圖5C）。

3 討論

某些參與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)蛋白被報(bào)道為膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，然而由于特異性和敏感性有限，只有少數(shù)在臨床中具有實(shí)用價(jià)值。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，許多miRNA被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和耐藥性[6]。某些miRNA可以作為腫瘤的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織miR-3653 表達(dá)下調(diào)；過(guò)表達(dá)miR-3653 明顯抑制膠質(zhì)瘤TG905 細(xì)胞的遷移和侵襲，而其表達(dá)下調(diào)則增強(qiáng)膠質(zhì)瘤TG905 細(xì)胞的侵襲能力。這表明過(guò)表達(dá)miR-3653，可通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲而發(fā)揮抗腫瘤作用。

EMT 是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，上皮型鈣黏蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白和波形蛋白是EMT的標(biāo)志分子。在EMT 過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞失去上皮特征，獲得間質(zhì)表型，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力[8]。本文結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-3653 導(dǎo)致上皮型鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯升高，神經(jīng)型鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)水平明顯降低，而抑制miR-3653 則相反。這表明，過(guò)表達(dá)miR-3653明顯抑制膠質(zhì)瘤TG905細(xì)胞EMT能力。

研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子（比如Twist 和Zeb 蛋白）是腫瘤細(xì)胞EMT 過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[9，10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，ZEB2 含有miR-3653 的互補(bǔ)序列，miR-3653可以通過(guò)這些互補(bǔ)序列與ZEB2的3'-UTR相互作用[11]。本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-3653 明顯抑制膠質(zhì)瘤TG905細(xì)胞ZEB2的表達(dá)；反過(guò)來(lái)，過(guò)表達(dá)ZEB2則明顯抑制miR-3653 過(guò)表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤TG905 細(xì)胞的作用。

總之，膠質(zhì)瘤組織miR-3653 呈低表達(dá)，通過(guò)靶向上調(diào)ZEB2，促進(jìn)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞侵襲、遷移能力。這提示miR-3653 可能會(huì)成為膠質(zhì)瘤新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。