任光輝 李武雄 齊利豪

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，病死率、致殘率高[1，2]。外泌體（exosomes，exo）是細(xì)胞在生理、病理?xiàng)l件下釋放到胞外的一種雙層膜囊泡，能與靶細(xì)胞受體結(jié)合或水平轉(zhuǎn)移內(nèi)含物而發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exo 能通過(guò)不同機(jī)制影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等[4]。本研究探討膠質(zhì)瘤干細(xì)胞外泌體（glioma stem cells exosomes，GSCs-exo）對(duì)體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)學(xué)細(xì)胞中心提供）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 GSCs 分離、培養(yǎng)及鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87 細(xì)胞，消化重懸后，轉(zhuǎn)移至干細(xì)胞培養(yǎng)液（上海索萊寶科技有限公司）培養(yǎng)至第3代細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至防脫載玻片，貼壁后以多聚甲醛固定，清洗后依次加入Nestin抗體、CD133 一抗（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜，清洗后加入FITC標(biāo)記的二抗（1∶400；德國(guó)默克公司），室溫下孵育1 h，避光處理，加入核襯染物DAPI，室溫孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)在有多聚左旋賴(lài)氨酸涂層的載波片上進(jìn)行第3代GSCs 誘導(dǎo)分化，常規(guī)培養(yǎng)5 d后，進(jìn)行GFAP熒光染色，2周后進(jìn)行Neun染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.3 GSCs-exo 的提取與鑒定 超速離心法提取exo。按照QIAAGEN GSCs-exo 提取試劑盒（上海李記生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)，收集GSCs 上清細(xì)胞培養(yǎng)液，加入XWP、XE 緩沖液分別離心洗滌、洗脫，獲得GSCs-exo 混合液固定，加入3%磷鎢酸溶液負(fù)染，透射顯微鏡下觀察GSCs-exo形態(tài)。RIPA裂解液（上海索萊寶科技有限公司）提取GSCs-exo 蛋白，10%SDS-PAGE電泳分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，加入CD63 一抗（1:500），4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1:5 000），孵育2 h，ECL曝光拍照。

1.4 干預(yù)與分組 取50 μl GSCs-exo，經(jīng)RIPA裂解液處理，BCA 試劑盒（上海紀(jì)寧生物科研試劑盒公司）測(cè)量蛋白濃度，以10% exo 血清培養(yǎng)液分別稀釋至20、40、80 μg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87 細(xì)胞接種于6孔板中，密度調(diào)整為1×105/孔，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組和高、中、低GSCs-exo 濃度組（分別加入20、40、80 μg/ml的GSCs-exo），每組5個(gè)復(fù)孔。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87 細(xì)胞侵襲能力100 μl 50 mg/L的Matrigel基質(zhì)膠1∶40稀釋液包被底部膜上室面。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔移入Transwell 小室，下層加入10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基500 μl，對(duì)照組、GSCs-exo組小室上室分別加入無(wú)血清1640 培養(yǎng)基150 μl 和重懸外泌體150 μl，37 ℃培養(yǎng)24 h，甲醇室溫固定10 min。侵襲置濾膜下表面的細(xì)胞以結(jié)晶紫染色，正置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87 細(xì)胞遷移能力 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，棄培養(yǎng)基，以50 μl 無(wú)菌移液槍頭在培養(yǎng)板中間劃線(xiàn)，后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。遷移率（%）=（初始劃痕寬度-24 h后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.7 免疫印記法檢測(cè)U87 細(xì)胞磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，Akt）、L1CAM 收集各組細(xì)胞，RIPA 裂解液處理，BCA 定量蛋白，SDS-PAGE 法分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉液封閉，加入一抗（1:2 000），4 ℃封閉過(guò)夜，加入二抗（1:10 000；廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司），室溫孵育2 h，ECL 顯影，分析目的條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行處理；定量資料以±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSCs 的鑒定結(jié)果 腫瘤細(xì)胞球由多個(gè)細(xì)胞組合而成，即GSCs（圖1）。熒光染色可見(jiàn)CD133（圖2a）與Nestin（圖2b）呈陽(yáng)性表達(dá)。誘導(dǎo)分化5 d 后GSCs分化成膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP 陽(yáng)性表達(dá)（圖2c），2 周后GSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，Neun陽(yáng)性表達(dá)（圖2d）。

2.2 GSCs-exo 鑒定結(jié)果GSCs-exo 為圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)，直徑30～100 nm，雙層膜包被（圖3a）。提取的GSCs-exo 總蛋白顯示表達(dá)相關(guān)標(biāo)志蛋白CD63（圖3b）。

2.3 GSCs-exo 對(duì)U87 細(xì)胞侵襲能力的影響 高濃度GSCs-exo 組侵襲細(xì)胞數(shù)量[（135.32±13.47）個(gè)]明顯高于中濃度GSCs-exo 組[（108.36±11.35）個(gè)；P＜0.05]，而中濃度GSCs-exo 組明顯高于低濃度GSCsexo 組[（88.45±8.23）個(gè)；P＜0.05]，低濃度GSCs-exo 組明顯高于對(duì)照組[（65.32±6.35）個(gè)；P＜0.05]。

2.4 GSCs-exo 對(duì)U87 細(xì)胞遷移能力的影響 高濃度GSCs-exo組細(xì)胞遷移率[（88.36±8.35）%]明顯高于中濃度GSCs-exo組[（72.39±7.25）%；P＜0.05]，而中濃度GSCs-exo 組明顯高于低濃度GSCs-exo 組[（46.35±6.89）%；P＜0.05]，低濃度GSCs-exo 組明顯高于對(duì)照組[（23.56±5.12）%；P＜0.05]。

圖1 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形態(tài)鑒定（×40

圖2 膠質(zhì)瘤干CD133、Nestin、GFAP、Neun免疫熒光染色鑒定（×40）

圖3 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞外泌體鑒定

圖4 免疫印跡法檢測(cè)GSCs-exo 對(duì)U87 細(xì)胞L1CAM、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

表1 GSCs-exo對(duì)U87細(xì)胞L1CAM、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

2.5 GSCs-exo 對(duì)U87細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，GSCs-exo組L1CAM、PI3K蛋白表達(dá)量及p-AKt/Akt比值明顯增高（P＜0.05），而且隨GSCs-exo 濃度增加明顯增高（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，GSCs-exo 能促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲和遷移，而且，GCSs-exo組L1CAM、PI3K與p-AKt/Akt 水平均明顯升高；均呈濃度依賴(lài)性。這說(shuō)明GSCs-exo 可上調(diào)L1CAM、PI3K 表達(dá)，促進(jìn)Akt磷酸化，從而促進(jìn)U87細(xì)胞侵襲和遷移。

GSCs可自我更新、多向分化、無(wú)限增殖，對(duì)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)及治療敏感性有決定性作用[4，5]。exo 在細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞中有重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，參與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exo，因攜帶miRNA、DNA 片段、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種功能分子，能為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件[6]。鄒敏等[7]研究顯示，缺氧環(huán)境下肝癌細(xì)胞分泌的exo，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵。Gong 等[8]發(fā)現(xiàn)，GSCs-exo能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

L1CAM 是細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族的重要成員[9]。張媛[10]研究發(fā)現(xiàn)，L1CAM能直傳遞雙向信號(hào)，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。另外，L1CAM 還可調(diào)控血管的生成，參與腫瘤的發(fā)展，并提高腫瘤細(xì)胞耐藥性[11]。PI3K 是具有催化活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，Akt 是PI3K 下游的靶向調(diào)節(jié)分子，Akt可在PI3K的磷化產(chǎn)物激活后發(fā)生質(zhì)-膜轉(zhuǎn)移而被激活，通過(guò)磷酸化作用影響胞漿內(nèi)的生物學(xué)信號(hào)傳遞，調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[12，13]。

綜上所述，GSCs-exo 可促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的侵襲與遷移，可能與上調(diào)L1CAM、PI3K 表達(dá)，促進(jìn)Akt磷酸化有關(guān)。