彭海瑩 田葉韓 李曉芳 張蕊 王德浩 梁元存 高克祥

摘? 要：針對煙草黑脛病和根黑腐病兩種煙草土傳病害日益加重的現狀，利用生防真菌棘孢木霉MX菌株和產紫青霉Q2菌株分別與植物誘抗劑氨基寡糖素進行組合，在盆栽條件下測定了其分別在兩種病害脅迫下的抗病效果。結果表明，產紫青霉Q2和棘孢木霉MX對煙草黑脛病菌和根黑腐病菌均有較強的拮抗作用，其發(fā)酵濾液能有效抑制兩種病原菌的生長，與氨基寡糖素組合后能夠更好地促進煙草幼苗的生長，對黑脛病和根黑腐病的防治效果均達到65%以上，能顯著提高發(fā)病煙草中防御酶PAL、SOD、POD的活性。

關鍵詞：煙草黑脛病;煙草根黑腐病;棘孢木霉;產紫青霉;氨基寡糖素;生物防治

Abstract： The present situation of two kinds of tobacco soil-borne diseases， black shank disease and root black rot disease， is increasing， which greatly aggravates the degree of tobacco diseases. In this study， two excellent biocontrol strains， Penicillium purpurogenum strain Q2 and Trichoderma asperellum strain MX， were used to combine with amino oligosaccharides， a plant inducer of disease resistance， respectively. Effects on tobacco growth promoting and control efficacy of tobacco black shank and black root rot have been investigated by two fungal biocontrol agents and their combination with amino oligosaccharides in the potting experiment. The results showed that P. purpurogenum strain Q2 and T. asperellum strain MX had strong antagonism against P. parasitica var. nicotianae and T. basicola， and the combination of them and amino oligosaccharides could better promote the growth of tobacco seedlings， and the control effect on the tobacco black shank and black root rot was more than 65%， which could significantly improve the activities of PAL， SOD and POD in the diseased tobacco.

Keywords： tobacco black shank; tobacco black root rot; Trichoderma asperellum; Penicillium purpurogenum; amino oligosaccharide; biological control

煙草黑脛病是由寄生疫霉菌煙草致病變種（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的土傳卵菌病害[1-3]，當環(huán)境條件有利時，任何生長階段都可發(fā)生。生長季節(jié)普遍存在的高溫高濕環(huán)境條件有利于病原菌的生長繁殖，使煙草黑脛病成為最難控制的疾病之一[4]。煙草根黑腐病是由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的土傳真菌病害，給煙草造成了不同程度的損失，已經成為世界性的主要煙草根莖病害之一。在田間，根黑腐病經常與煙草黑脛病同時發(fā)生，使危害程度加重，防治也更加困難[5-7]。目前的防治措施主要為化學防治，但化學農藥的大量施用，不僅增加成本，也會危害環(huán)境及人體健康。并且已有研究發(fā)現煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉和甲霜靈等化學農藥出現抗性風險[8-9]，因此探索生物防治尤為重要[10-11]。

青霉菌的許多菌株能產生有機酸等有益物質，具有較好的抑制病原菌和促進作物生長的作用，可用于作物病害的生物防治[12-13]。木霉菌是目前防治植物病害最有應用前途的生防真菌，研究發(fā)現木霉菌是一種相當特異的真菌寄生菌，木霉菌產生的β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶，能夠降解宿主真菌的細胞壁[14]，并且木霉對根系生長發(fā)育有積極作用，可以提高作物生產力和養(yǎng)分吸收，是一種優(yōu)良的生防真菌。

單獨使用生防菌會出現防效不穩(wěn)定、防效較低等問題，氨基寡糖素作為一種植物誘抗劑，能夠激發(fā)植物體產生防御反應從而減輕病原菌對植物的侵害[15-16]。已有研究證實生防菌與植物誘抗劑復配能有更好的防病促生效果，比如金龜子綠僵菌加枯草芽孢桿菌與氨基寡糖素組合后能促進番茄植株的生長，番茄增產率達29.84%[17]。本試驗用棘孢木霉菌和產紫青霉菌分別與氨基寡糖素組合使用，探索其對煙草黑脛病和根黑腐病的防治效果，以期為煙草黑脛病和根黑腐病等土傳病害的生物防治提供技術支持。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料、時間

供試菌株：棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）MX菌株、產紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）Q2菌株、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）Ppn菌株和根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）Tb菌株均由本實驗室分離保存。

供試煙草品種為NC89，供試藥劑為5%氨基寡糖素水劑，由海南正業(yè)中農高科股份有限公司生產。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，PDB培養(yǎng)基，燕麥培養(yǎng)基，V8培養(yǎng)基[18-19]。

試驗于2018年7月—2019年11月在山東農業(yè)大學山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室進行。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 平板對峙試驗? 采用平板對峙法[19]。將煙草黑脛病菌和根黑腐病菌分別與棘孢木霉菌MX和產紫青霉菌Q2做平板對峙，以只接種病原菌的平板作為對照（CK），計算兩種生防真菌分別對病原菌的抑制率。

1.2.2? 生防菌發(fā)酵濾液對兩種病原菌菌絲生長的影響? 發(fā)酵濾液的制備：選取在PDA上生長良好的產紫青霉Q2和棘孢木霉MX，打取菌餅，每瓶PDB培養(yǎng)基接種3個菌餅，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，木霉MX培養(yǎng)5 d，青霉Q2培養(yǎng)7 d，3層紗布過濾，棄菌絲，將濾液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，用孔徑為0.22 μm細菌過濾器過濾后得到無菌發(fā)酵濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將90 mL定量PDA培養(yǎng)基加熱熔化后冷卻至45 ℃時，加入10 mL無菌發(fā)酵濾液混合均勻，發(fā)酵濾液終濃度為10%;對照組（CK）加入等量無菌水。在培養(yǎng)皿中心接種病原菌菌餅，27 ℃條件下培養(yǎng)7 d，測量菌落半徑并計算抑制率[19]。

1.2.3? 生防菌發(fā)酵濾液對病原菌孢子萌發(fā)的影響? 制備根黑腐病菌分生孢子懸浮液和黑脛病菌游動孢子懸浮液，取15 μL病原菌孢子懸浮液滴于載玻片中央，不同處理分別加入15 μL的Q2和MX發(fā)酵濾液，對照組（CK）加入等量無菌水代替發(fā)酵濾液，各組重復3次，采用載玻片懸滴保濕法，25 ℃培養(yǎng)，待對照組的孢子約有60%～80%萌發(fā)時，統(tǒng)計各處理視野內孢子總數以及萌發(fā)數，并計算孢子萌發(fā)抑制率：抑制率=（對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率）/對照組孢子萌發(fā)率×100%

1.2.4? 生防菌與氨基寡糖素的相容性試驗? 將5%氨基寡糖素水劑產品用無菌水稀釋1000倍。90 mL定量PDA培養(yǎng)基加熱熔化后加入10 mL配制好的氨基寡糖素，混合均勻，以不加氨基寡糖素而加入10 mL無菌水為對照。每培養(yǎng)皿倒入25 mL培養(yǎng)基，晾涼后在平板中心接種直徑5 mm的青霉Q2和木霉MX菌餅，27 ℃黑暗培養(yǎng)，青霉培養(yǎng)10 d，木霉培養(yǎng)6 d，測量菌落直徑并拍照，觀察青霉Q2和木霉MX與氨基寡糖素是否具有相容性。

1.2.5? 生防菌及其與氨基寡糖素組合對煙草幼苗促生效果試驗? 在口徑為15 cm的花盆中放入500 g健康土，設置6個處理：①清水對照（CK）;②A，氨基寡糖素;③Q2+A，青霉Q2孢子+氨基寡糖素;④Q2，青霉Q2孢子;⑤MX+A，木霉MX孢子+氨基寡糖素;⑥MX，木霉MX孢子。青霉Q2孢子施用方法為在幼苗移栽前取10 mL孢子懸浮液（濃度為1×107 cfu/mL）均勻拌入土中，使土中青霉Q2孢子濃度為2×105 cfu/g;木霉MX孢子施用方法為取濃度為1×108 cfu/g的孢子粉進行穴施，每穴2 g。兩種生防菌使用濃度均為在本試驗前期篩選過的最佳濃度。選取健康、長勢一致的煙苗進行移栽，移栽后相應處理每株噴施稀釋1000倍的氨基寡糖素液10 mL。每處理12株，設3個重復。本試驗在人工溫室中進行，保證各處理溫度及水分管理一致。在移栽30 d后測量株高、莖粗、葉片數、最大葉長和葉寬等生長指標，40 d時測定煙株地上部和地下部鮮質量和干質量并參考趙成剛[20]的方法計算根冠比。

1.2.6? 生防菌及其與氨基寡糖素組合對煙草黑脛病和根黑腐病的防治效果試驗? （1）對煙草黑脛病的防治效果：在規(guī)格為70 cm×40 cm×10 cm的方形塑料盆中裝入4 kg健康土，每盆種18株煙苗作為一個處理，重復3次。共設置7個處理，分別為：①CK0：空白對照不加病原菌;②CK1：加病原菌，每株灌根接種濃度為2×105 cfu/mL黑脛病菌的游動孢子懸浮液10 mL;③A：病原菌+氨基寡糖素;④Q2+A：病原菌+青霉Q2孢子+氨基寡糖素;⑤Q2：病原菌+青霉Q2孢子;⑥MX+A：病原菌+木霉MX孢子+氨基寡糖素;⑦MX：病原菌+木霉MX孢子。移栽前在土壤中加入生防菌，移栽煙苗時傷根并加入病原菌，煙苗移栽后噴施氨基寡糖素。氨基寡糖素施用方法同1.2.5;青霉Q2孢子施用方法：在幼苗移栽前取80 mL孢子懸浮液（濃度為1×107 cfu/mL）均勻拌入土中，使土中青霉Q2孢子濃度為2×105 cfu/g;木霉MX孢子施用方法：取稀釋濃度為1×108 cfu/g的孢子粉進行穴施，每株2 g。接種15 d后，采用國家標準GB/T 23222—2008《病害分級標準》，調查各處理的發(fā)病率和病情指數，并計算防治效果。

（2）對煙草根黑腐病的防治效果：用灌根法每株接種10 mL濃度為2×105 cfu/mL的根黑腐病菌分生孢子懸浮液，各處理的設計和藥劑用量與方法同上。接種后21 d，采用GB/T 23222—2008《病害分級標準》，計算各處理的發(fā)病率、病情指數以及防治效果。

1.2.7? 生防菌及其與氨基寡糖素組合處理煙草中防御酶的測定? 分別在1.2.6試驗中煙苗移栽后1、3、5、7、9 d五個時間點取樣，每處理隨機取3株煙苗，液氮研磨后?80 ℃保存，用于以下防御酶活性的測定，每試驗重復3次。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）的測定參考曹建康等的方法[21]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性的測定采用北京索萊寶科技有限公司的檢測試劑盒，具體方法參考產品說明書。

1.3? 數據統(tǒng)計處理

采用Excel 2007進行數據處理和繪圖，用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行方差分析和差異顯著性檢驗，圖表中數據為平均值±標準差。

2? 結? 果

2.1? 生防菌對病原菌的拮抗能力

平板對峙試驗結果顯示（表1），由于木霉MX生長速度較快，迅速搶占病原菌的生存空間，對病原菌的平板拮抗效果較好，其中對黑脛病菌的抑制率為80.43%，對根黑腐病菌的抑制率為73.58%，青霉Q2由于生長速度小于木霉，其平板抑制率略低。說明Q2和MX對兩種病原菌的生長都有拮抗作用。

從表2可以看到，煙草黑脛病菌和根黑腐病菌在含有不同真菌發(fā)酵濾液培養(yǎng)基中生長7 d后，MX濾液對于煙草黑脛病菌菌絲生長影響很小，而Q2濾液則具有很強抑制作用，抑制率為61.72%，與對照相比差異顯著。對于根黑腐病菌的菌絲生長，MX濾液和Q2濾液的抑制效果都比較顯著，其中Q2濾液抑制率遠高于MX濾液。表明Q2濾液較MX濾液有更強的抑制兩種病原菌菌絲生長的能力。

對于黑脛病菌游動孢子和根黑腐病菌分生孢子的萌發(fā)，Q2和MX發(fā)酵濾液均有不同程度的抑制作用（表3），以Q2發(fā)酵濾液最為顯著。其中Q2濾液處理的黑脛病菌游動孢子萌發(fā)率比CK低40.25百分點，而MX發(fā)酵濾液對游動孢子萌發(fā)的影響較小，僅比CK低7.40百分點。用Q2濾液處理后根黑腐病菌分生孢子萌發(fā)極少，比CK的萌發(fā)率降低86.14百分點，而MX濾液處理后孢子萌發(fā)率稍有下降，僅比CK降低13.41百分點。說明與木霉MX菌株相比，青霉Q2菌株的發(fā)酵濾液對病原菌孢子萌發(fā)有更強的抑制作用，能夠抑制病原菌的生長繁殖從而影響其對植株的侵染。

2.2? 生防菌與氨基寡糖素的相容性

從圖1中可以看出，加入氨基寡糖素（A）并沒有影響棘孢木霉MX菌株和產紫青霉Q2菌株的菌絲生長，與對照的菌落大小沒有差別;但是木霉MX在加入氨基寡糖素的培養(yǎng)基中菌絲茂密且生長旺盛，中間已經開始產孢，較CK來說有更早產孢的趨勢，青霉Q2在含有氨基寡糖素的培養(yǎng)基中生長較好，且產生具有殺菌效果的紅色物質。說明氨基寡糖素與木霉MX菌株和青霉Q2菌株有較好的相容性，可以組合使用。

2.3? 生防菌及其與氨基寡糖素組合對煙草幼苗生長的影響

移栽后30 d的調查結果顯示（表4），各個處理的煙株各項農藝性狀與對照相比均有不同程度的提高，其中以MX+A處理的效果最為顯著，其株高、莖粗、葉長、葉寬分別比CK處理提高了57.10%、20.21%、33.62%、35.08%，其次是Q2+A和MX處理，這兩個處理效果差異不明顯，然后是Q2和A。

不同處理的煙株鮮質量和干質量與對照組相比都有顯著性提高，其中A、Q2+A、Q2、MX+A、MX處理組的鮮質量分別比CK處理增加了14.75%、25.76%、25.26%、32.26%、27.44%，干質量分別比CK增加了21.81%、39.36%、29.26%、52.13%、46.28%，MX+A對于增加鮮質量和干質量的效果最好，其次是MX和Q2+A。加入MX和Q2還能提高煙草的根冠比，其中MX的效果優(yōu)于Q2。

以上說明木霉MX菌株的促生效果優(yōu)于青霉Q2菌株，噴施氨基寡糖素能較好地促進煙草的生長，其與生防菌MX和Q2組合能產生更好的促生效果。

2.4? 生防菌及其與氨基寡糖素組合對煙草黑脛病和根黑腐病的防治效果

在溫室栽苗15 d后對煙草黑脛病進行病情調查（表5），CK0處理煙苗無發(fā)病，CK1處理全部發(fā)病，用Q2處理的煙苗發(fā)病率最低，為39.39%，其次是用MX處理的，發(fā)病率為51.52%。氨基寡糖素對發(fā)病率影響較小，但是能夠有效降低病情指數。Q2和MX分別與氨基寡糖素組合后防病效果都好于單獨施用，其中Q2+A防病效果最好。說明青霉Q2菌株和木霉MX菌株對防治煙草黑脛病都有較好的效果，與氨基寡糖素組合防病效果更佳。

在溫室栽苗21 d后對根黑腐病進行病情調查（表5），結果顯示CK1處理發(fā)病率為84.85%，單獨使用氨基寡糖素后發(fā)病率稍有下降，為75.76%，防病效果為49.46%，且能有效降低病情指數。Q2+A處理和Q2處理的發(fā)病率差別較小，而MX與氨基寡糖素組合則有效降低了發(fā)病率。說明青霉Q2菌株和木霉MX菌株對煙草根黑腐病的防治效果相近，但與氨基寡糖素組合后能發(fā)揮更好的防病作用。

2.5? 生防菌及其與氨基寡糖素組合處理對發(fā)病煙草中防御酶的影響

由圖2可見，在接種煙草黑脛病菌后，各生防菌及與氨基寡糖素組合處理的PAL、POD、SOD活性均高于空白對照CK0和病原對照CK1。Q2+A處理的PAL、POD、SOD活性分別在第9、5、3天達到峰值，比CK1處理提高了61.66%、36.07%、85.21%。

而接種煙草根黑腐病菌后，各個處理的PAL、POD、SOD活性總體均呈先升高后下降趨勢，空白對照CK0處理的活性一直保持較低水平且比較穩(wěn)定。PAL、POD、SOD活性分別在第5、3、5天時達到峰值，且均為Q2+A處理的活性最高，分別比CK1處理高出43.30%、44.44%、59.13%（圖2）。綜合來看，在黑脛病菌和根黑腐病菌脅迫下，青霉Q2菌株和木霉MX菌株與氨基寡糖素組合都能夠誘導煙草組織內PAL、POD、SOD活性的提高，從而在煙草遭受病原菌侵害時增強其抗病性。

3? 討? 論

有益的土壤微生物群體對于作物土傳病害有一定程度的抑制作用[22]，選擇優(yōu)良的拮抗菌對防治土傳病害具有重要意義，青霉菌和木霉菌作為優(yōu)良拮抗菌已有較多研究報道。WONGLOM等[23]研究表明，木霉菌T76-12/2釋放的揮發(fā)物抑制了菌核病菌LS01和SZ01的菌絲生長，抑制率分別為81.48%和78.33%。本試驗初步驗證了產紫青霉Q2菌株和棘孢木霉MX菌株分別對煙草黑脛病菌和根黑腐病菌有較強的拮抗作用，青霉Q2的發(fā)酵濾液與木霉MX發(fā)酵濾液相比有更強的抑菌效果，能有效抑制兩種病原菌的菌絲生長、根黑腐病菌孢子萌發(fā)、黑脛病菌孢子囊產生以及游動孢子萌發(fā)，證明青霉Q2菌株和木霉MX菌株能有效抑制病原菌的生長和繁殖，為產紫青霉Q2菌株和棘孢木霉MX菌株作為優(yōu)良拮抗菌提供了理論依據。

青霉菌和木霉菌除有較好的防病作用外，還能促進各類植物的生長。有研究證明木霉菌對煙草黑脛病有較好的防效，并能促進煙草種子萌發(fā)和根系生長[24]。王海波等[13]溫室試驗證明青霉QMYCS-2菌株發(fā)酵濾液能有效防治煙草黑脛病，防效達73.25%。與其相似，本試驗在分別施加青霉Q2或木霉MX后都促進了煙草幼苗的生長，有效降低煙草黑脛病和根黑腐病的發(fā)病率和病情指數。生防菌與氨基寡糖素組合后表現出更好的促生防病效果。但是，在本試驗中生防菌用量和施加時期的設置較為單一，沒有對適合煙草生長的生防菌最佳濃度進行篩選，對于氨基寡糖素的用量，本試驗采用了產品說明書中參考濃度范圍的較低值，缺乏生防菌與氨基寡糖素的最佳配比研究，這需要在后期田間應用時進一步試驗。

植物與病原菌互作是一個復雜的過程，在植物的抗病性中防御酶起著至關重要的作用[25]。諸多研究證實PAL、SOD、POD活性的升高均能反映植株抗病性的增強。NARAYAN等[26]研究表明，生防菌通過增強抗氧化酶防御系統(tǒng)幫助植物克服病害脅迫，生物保護作用是通過系統(tǒng)誘導宿主植物的抗氧化防御來介導的。本試驗在分別接種煙草黑脛病菌和根黑腐病菌后，青霉Q2菌株和木霉MX菌株與氨基寡糖素組合使用后，均能有效誘導煙草植株內PAL、SOD、POD活性的升高，從而增強煙草的抗病性。生防菌對于煙草黑脛病和根黑腐病植株的各項生理反應有較大影響，原因可能是病原菌被青霉Q2菌株及其次生代謝產物抑制從而減少了其對根部和植株的侵染，而木霉MX菌株則可能是因為其易在根部定殖，與病原菌搶占生長位點，從而有效促進植株生長并抵御病原菌的危害。但產紫青霉Q2菌株和棘孢木霉MX菌株與植物和病原菌之間的互作關系以及抗病機理還需深入的研究。

4? 結? 論

研究結果顯示拮抗真菌與氨基寡糖素組合后能有效促進煙草植株的生長，對黑脛病和根黑腐病有良好的防治效果，并且能在病原菌脅迫下提高煙草的防御酶活性從而增強其抗病性，為煙草病害的生物防治提供了思路和方法。

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