鞠馥竹 張洪博 閆寧 杜詠梅 張忠鋒 付秋娟 柳林青 劉靜 劉艷華

摘? 要：煙草西柏三烯二醇（CBT-diols）不僅是煙葉中香氣成分的重要前體物質，還具有抗癌、抗菌等生物活性，為揭示CBT-diols含量的遺傳模型及遺傳效應，本研究以高CBT-diols含量種質織金黑吊把和低CBT-diols含量種質Mont Clame Brun為親本配制雜交組合，獲得P1、P2、F1、F2的四世代遺傳分析群體，測定F2群體單株CBT-diols含量，利用“主基因+多基因”混合遺傳模型對CBT-diols含量相關基因進行遺傳分析。結果表明，α-CBT-diol、β-CBT-diol與CBT-diols含量3個性狀均受2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因（E-0）控制，2對主基因的加性效應均為正值，顯性效應值均為負值，且第1對主基因的加性效應及顯性效應均高于第2對。CBT-diols含量3個性狀的主基因遺傳率分別為76.96%、76.88%、77.55%，多基因遺傳率不到1%。因此，CBT-diols含量主要受2對主基因遺傳效應的影響。

關鍵詞：煙草;西柏三烯二醇;主基因+多基因;遺傳分析

Abstract： Cembratrien-diols （CBT-diols） in tobacco is not only an important precursor substance of aroma components in tobacco leaves， but also has anti-cancer， antibacterial and other medicinal values. To reveal the genetic model and genetic effect of CBT-diols content， an F2 population was developed by crossing between the high CBT-diols content germplasm Zhijinheidiaoba （maternal parent） and low CBT-diols content germplasm Mont Clame Brun （paternal parent）. Genetic analysis was carried out by using joint segregation analysis method with a mixed genetic model of major gene plus polygene.Results from genetic analysis showed that α-CBT-diol， β-CBT-diol and CBT-diols contents were controlled by 2 pairs of additive-dominant-epigenetic major genes plus additive-dominant-epigenetic polygenes （E-0）. The additive effects of the two major genes were all positive， and the dominant effects were negative， and the additive and dominant effects of the first pair of major genes were stronger than those of the second pair. The heritability of the major genes of the 3 traits of CBT-diols content was 76.96%， 76.88%， and 77.55%， the polygenic inheritance rate was less than 1%. In general， the genetic effect inheritance of the 2 pairs of main genes was dominant in the three traits. Therefore， the content of CBT-diols was mainly affected by genetic effect， and the genetic effects of the major genes were the main genetic effects.

Keywords： tobacco; cembratrien-diols; major gene plus polygenes; genetic analysis

西柏三烯二醇（Cembratrien-diols， CBT-diols）是煙草腺毛主要分泌物，占腺毛總分泌物的60%左右[1]，屬于萜類化合物中的西柏烷型二萜，并且存在兩種同分異構體α-CBT-diol和β-CBT-diol。CBT-diols在煙葉調制和陳化過程中可降解為茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮等成分，是煙葉香氣物質的重要前體物，另外，CBT-diols還具有抗腫瘤、抗菌及延緩衰老等生物活性，具有重要的醫(yī)藥價值。

CBT-diols含量在煙草不同類型種質、不同器官以及不同葉位間均存在顯著差異，付秋娟等[2]對不同種質CBT-diols含量進行了檢測，結果表明，供試種質煙花CBT-diols含量范圍為0.08%～3.47%，其中曬煙>香料煙>烤煙>雪茄>白肋煙;劉翠翠等[3]利用UPLC方法對不同類型煙草種質CBT-diols含量進行鑒定結果表明，烤煙>曬煙>香料煙>雪茄>白肋煙，二者研究結果均表明不同煙草類型種質CBT-diols含量差異顯著，且雪茄煙和白肋煙CBT-diols含量最低。另外，NIELSEN等[4]、鞠馥竹等[5]研究表明，CBT-diols含量的遺傳受加性效應和顯性效應的影響，不同種質間其遺傳效應不同，且煙草CBT-diols含量是受多基因控制的，但控制該性狀的多基因是否存在主效基因，主效基因間是否存在互作等研究未見報道。本研究利用高、低CBT-diols含量的煙草種質配制雜交組合，構建F2代遺傳群體，對P1、P2、F1、F2四世代CBT-diols含量進行檢測，并利用主基因+多基因混合遺傳模型對四世代進行遺傳分析。以確定CBT-diols含量的遺傳模型，揭示其遺傳機制，為通過遺傳改良提高CBT-diols含量提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

供試材料為CBT-diols含量差異顯著的織金黑吊把（P1）和Mont Clame Brun（P2）煙草品種。田間試驗于2018—2019年在山東濰坊煙草有限公司諸城分公司試驗站進行，2018年7月以織金黑吊把為母本、Mont Clame Brun為父本配制雜交組合，獲得F1，2018年10月，將F1于溫室種植套袋自交，獲得F2代種子;2019年將P1、P2、F1和F2全部材料進行田間種植。親本（P1、P2）種植2行區(qū)共50株，F(xiàn)1種植2行區(qū)共50株，F(xiàn)2種植10行區(qū)共250株。株行距120 cm×50 cm，田間管理按當地統(tǒng)一模式進行。

1.2? 樣品制備

在團棵期（移栽后30 d）對P1、P2、F1、F2全部群體單株進行取樣，每株取第3葉位的葉片，并用錫箔紙包好，帶回實驗室放入冷凍冰柜（?20 ℃）進行貯存。冷凍干燥前，先用液氮浸泡10 min，之后放入冷凍干燥機進行冷凍干燥，72 h后取出磨樣。

1.3? CBT-diols含量測定

采用付秋娟等[6]的方法對四世代材料進行α-CBT-diol和β-CBT-diol含量測定。CBT-diols含量為α-CBT-diol含量和β-CBT-diol含量之和。

1.4? 數據分析

利用SPSS 25繪制F2群體頻率分布直方圖。采用植物數量性狀主基因+多基因混合遺傳模型多世代聯(lián)合分析方法，對P1、P2、F1和F2群體的CBT-diols含量進行遺傳效應分析。由模型的極大似然值（Maxlike Lihood Values， MLV）計算出AIC（Akaikes information criterion）值，根據最小AIC值原則，選擇AIC值最小或相對較小的幾組模型為備選模型，同時進行一組樣本分布與模型所代表的理論分布間的適合性檢驗，包括均勻性檢驗（U12、U22、U32）、Smirnov檢驗（nW2）和Kolmogorov檢驗（Dn），根據適合性檢驗結果在備選模型中選出最佳遺傳模型，同時選得相應的各成分分布參數。利用SEA軟件中最小二乘法原理計算最佳模型中的一階遺傳參數和二階遺傳參數[7-10]。

2? 結? 果

2.1? CBT-diols含量表型數據分析

對四世代CBT-diols含量進行檢測后結果顯示（表1），2個親本（P1、P2）的α-CBT-diol含量平均值分別為0.278 0%、0.041 3%，β-CBT-diol含量平均值分別為0.190 9%、0.030 3%，總CBT-diols含量平均值分別為0.468 9%、0.071 6%，兩親本之間CBT-diols含量差異較大。F1的α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量平均值分別為0.056 6%、 0.043 5%、0.100 0%，介于兩親本之間，并略高于低值親本。F2群體的α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量平均值分別為0.138 7%、0.099 2%、0.237 9%，雖明顯高于P2各性狀平均值，但未達到中親值。變異系數揭示了群體的數量性狀之間的分離情況，分離群體F2的3個性狀的變異系數分別為65.19%、62.52%、64.05%，均高于P1、P2及F1三世代的變異系數，并且F2群體在3個性狀中均有超親個體出現(xiàn)，說明分離世代具有更豐富的遺傳變異。3個性狀在四世代中偏度系數在?0.018 3～0.955 7之間，峰度系數在?1.329 3～0.827 4之間，從圖1中也可以看出，F(xiàn)2群體的3個性狀的含量均呈正偏態(tài)分布，推測α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量可能均是主基因和多基因共同控制的數量性狀，可利用主基因和多基因混合遺傳模型進行進一步分析。

2.2? CBT-diols含量主基因+多基因混合遺傳分析

2.2.1? 遺傳模型的選擇? 利用植物數量性狀主基因+多基因混合遺傳模型中的多世代聯(lián)合分析方法進行分析，獲得5類共24種模型的MLV和AIC值（表2）。根據AIC值最小準則，選取AIC值最小的一組和接近最小的一組遺傳模型作為備選模型。結果表明在這24種模型中，α-CBT-diol的B-1（2MG-ADI）及E-0（MX2-ADI-ADI）模型的AIC值最低，分別為?851.42、?854.33。β-CBT-diol的B-1（2MG-ADI）及E-0（MX2-ADI-ADI）模型的AIC值最低，分別為?1 107.91、?1 112.30。CBT-diols的B-1（2MG-ADI）及E-0（MX2-ADI-ADI）模型的AIC值最低，分別為?500.95、?504.64，可作為備選模型。從上述結果可以看出，3個性狀中均可選擇B-1（2MG-ADI）及E-0（MX2-ADI-ADI）為備選模型。

2.2.2? 備選模型的適合性檢測與最優(yōu)遺傳模型估算? 對CBT-diols含量性狀的備選模型進行均勻性檢驗和Kolmogorov-Smirnov檢驗，分別獲得其統(tǒng)計量U12、U22、U32、nW2和Dn及其p值（表3），選擇備選模型中達到顯著水平的統(tǒng)計量個數最少且AIC值最小的模型為最優(yōu)模型。結果顯示，α-CBT-diol的E-0（MX2-ADI-ADI）模型中達到顯著差異（p<0.05）的統(tǒng)計量有3個，B-1（2MG-ADI）模型達到顯著差異的統(tǒng)計量有4個，E-0的AIC值最小;β-CBT-diol的E-0模型中達到顯著差異的統(tǒng)計量有4個，B-1模型達到顯著差異的統(tǒng)計量有4個，E-0的AIC值最小;CBT-diols的E-0模型中達到顯著差異的統(tǒng)計量有3個，B-1模型達到顯著差異的統(tǒng)計量有3個，但E-0的AIC值最小。由上述結果可知，CBT-diols含量相關的3個性狀符合E-0（MX2-ADI-ADI）模型，即2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因遺傳模型。

2.2.3? 遺傳參數估計? 根據選擇的最優(yōu)模型（E-0）估算CBT-diols含量性狀的一階遺傳參數和二階遺傳參數（表4），控制α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量的第1對主基因的加性效應（da）分別為0.096、0.067、0.162 3，均為正向遺傳效應，第2對主基因的加性效應（db）分別為0.035 8、0.027 2、0.063 6，同樣也為正向遺傳效應，說明第1對主基因加性效應大于第2對，并且2對主效基因進行累加可提高CBT-diols的含量;3個性狀的第1對主基因的顯性效應（ha）分別為?0.035 8、?0.027 2、?0.063 6，第2對主基因的顯性效應（hb）分別為?0.030 3、?0.021 3、?0.049 2，2對主基因的顯性效應均為負向效應，且第1對主基因顯性效應略強于第2對主基因。3個性狀第1、2對主基因顯性度（h/d）均在?1～0之間，呈負向部分顯性。3 個性狀的2對主基因加性×加性上位性效應（i）分別為0.035 8、0.027 2、0.063 6，數值與第2對主基因的加性效應（db）相同，均為正向效應。2對主基因加性×顯性上位性效應（jab）分別為?0.030 3、?0.021 3、?0.049 2，為負向效應;2對主基因顯性×加性上位性效應（jba）分別為0.024 5、0.012 7、0.035 1，為正向遺傳效應;2對主基因顯性×顯性上位性效應（l）分別為?0.027 1、?0.016 8、?0.045 2，為負向遺傳效應。α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量的主基因遺傳率分別為76.96%、76.88%、77.55%，主基因加性效應分別為0.131 8、0.094 2、0.225 9，顯性效應分別為?0.066 1、?0.048 5、?0.112 8，但多基因的加性及顯性效應未檢測到，故3個性狀的遺傳以2對主基因的遺傳為主?？傮w來說，α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量的遺傳效應大小分別為：CBT-diols>α-CBT-diol> β-CBT-diol，并且3個性狀的第1對主基因的加性、顯性及上位性效應均大于第2對主基因。

3? 討? 論

CBT-diols是煙草表面腺毛分泌物的主要成分，由于CBT-diols是由煙草植株表面腺毛的腺頭細胞產生，其分泌后即留在植株表面，直接暴露在外界環(huán)境中，故環(huán)境變化對其含量的影響較大。有大量研究證明，土壤、肥料、水分、海拔、溫度、光照等環(huán)境因素對CBT-diols含量均產生了直接或間接的影響。鑒于此，本試驗在試驗設計方面，各世代材料種植的土壤、肥料、海拔、溫度以及光照等環(huán)境條件均保證了一致性。另外，取樣方面，選取發(fā)育5～7 d、未經雨水的新葉（10～15 cm），保證了單株取樣的一致性，提高了研究結果的可信度。煙草中CBT-diols含量是由多基因控制的數量性狀[11]，每個基因都對性狀的表型產生或多或少的影響，性狀沒有明顯的表型分組趨勢。

傳統(tǒng)數量遺傳學一般只能將控制一個數量性狀的所有基因作為一個整體進行研究，并不能得到具體到某個基因的遺傳信息。而本研究利用主基因+多基因混合模型的方法研究煙草CBT-diols含量的遺傳模式，可將多基因分為主效基因和微效基因，并能明確各基因的遺傳參數，為下一步通過高通量測序開發(fā)SNP、QTL初步定位及精確定位，闡明各性狀的多基因遺傳調控網絡及其互作調控關系以及分子設計育種提供重要理論依據。

四世代CBT-diols含量統(tǒng)計結果表明，P1、P2、F1及F2的CBT-diols含量平均值分別為0.468 9%、0.071 6%、0.100 0%、0.237 9%，F(xiàn)1及F2含量平均值均未達到中親值，并傾向于低值父本，可在F2分離群體中選擇CBT-diols含量較高的個體進行連續(xù)多代自交，以提高獲得高含量優(yōu)異后代的可能性。在控制環(huán)境條件一致的條件下，利用遺傳改良手段提高后代CBT-diols含量、創(chuàng)制高含量種質是一種高效可行的方法。對CBT-diols含量相關的3個性狀遺傳模型進行篩選后確定最優(yōu)遺傳模型均是E-0（MX2-ADI-ADI）模型即2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因遺傳模型。這說明控制3個性狀的2對主基因具有明顯的加性-顯性-上位性作用，多基因也具有加性-顯性-上位性效應。α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量3個性狀的主基因遺傳率依次為76.96%、76.88%、77.55%，而α-CBT-diol多基因遺傳率僅為0.55%，其余兩個性狀的多基因遺傳率為0，這說明該性狀在遺傳上非常穩(wěn)定，因此可以將3個性狀的主基因遺傳率視為該性狀的廣義遺傳率。

鞠馥竹等[5]利用10個煙草品種進行了不完全雙列雜交，并對其后代CBT-diols含量進行了檢測，對遺傳率進行估計后得到α-CBT-diol、β-CBT-diol及CBT-diols含量3個性狀的廣義遺傳率分別為70.61%、68.02%、70.06%，與本研究中CBT-diols含量的廣義遺傳率相近。前人研究僅僅揭示了CBT-diols含量的遺傳效應及遺傳率，而本研究結果則進一步明確了3個性狀主要受2對主效基因的影響，且主效基因的遺傳效應大于多基因的遺傳效應。因此，在CBT-diols含量育種實踐中應充分考慮主效基因的影響，可以選擇高CBT-diols含量親本為輪回親本來選育高含量優(yōu)異后代。同時，下一步還需從分子水平上進行QTL定位研究，最終為CBT-diols含量分子標記輔助選擇以及圖位克隆提供理論基礎和技術支持。

4? 結? 論

本研究以高CBT-diols含量種質織金黑吊把為母本、低CBT-diols含量種質Mont Clame Brun為父本構建了F2遺傳群體，并以四世代群體為材料對CBT-diols含量進行主基因+多基因遺傳分析，結果表明，CBT-diols含量相關性狀的遺傳符合2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因（E-0）遺傳模型，2對主基因的加性效應均為正值，顯性效應均為負值，且第1對主基因的加性效應及顯性效應均強于第2對。CBT-diols含量3個性狀的主基因遺傳率分別為76.96%、76.88%、77.55%，多基因遺傳率不到1%?？傮w來說，CBT-diols含量相關的3個性狀以2對主基因遺傳為主，主基因的遺傳效應大于多基因的遺傳效應。本研究結果為CBT-diols含量分子標記輔助選擇奠定了基礎，為高CBT-diols含量資源的篩選和高效利用提供了保障。

參考文獻

[1]JOHNSON A W， SEVERSON R F， HUDSON J， et al. Tobacco leaf trichomes and their exudates[J]. Tob Sci， 1985， 29： 67-72.

[2]付秋娟，劉艷華，杜詠梅，等. 我國煙草資源西柏三烯二醇含量分析[J]. 中國煙草學報，2019，25（5）：10-14.

FU Q J， LIU Y H， DU Y M， et al. Analysis of cembratriendiol contentin tobaccos growing in China[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2019， 25（5）： 10-14.

[3]劉翠翠. 煙草西柏三烯二醇檢測方法及其積累動態(tài)、分布研究[D]. 北京：中國農業(yè)科學院，2016.

LIU C C. Establishment and application of a detection method for investigating the accumulation， distribution of cembratrien-diols in tobacco[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2016.

[4]NIELSEN M T， SEVERSON R F. Inheritance of a diterpene constituent in tobacco trichome exudate[J]. Crop Science， 1992， 32（5）： 1148-1150.

[5]鞠馥竹，張洪博，閆寧，等. 烤煙西柏三烯二醇含量遺傳效應分析[J]. 分子植物育種，2020，18（8）：2633-2640.

JU F Z， ZHANG H B， YAN N， et al. Analysis on genetic effects of cembratrien-diol content in flue-cured tobacco[J]. Molecular Plant Breeding， 2020， 18（8）： 2633-2640

[6]付秋娟，杜詠梅，劉新民，等. 超高效液相色譜法測定煙草西柏三烯二醇[J]. 中國煙草科學，2017，38（3）：67-73.

FU Q J， DU Y M， LIU X M， et al. Determination of cembratriene-diol in tobacco by ultra performance liquid chromatography[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（3）： 67-73.

[7]章元明，蓋鈞鎰. 利用P1、F1、P2、F2和F2：3家系五世代聯(lián)合分離分析的拓展[J]. 生物數學學報，2002（3）：363-368.

ZHANG Y M， GAI J Y. An expansion of the joint segregation analysis of P1、F1、P2、F2 and F2：3 generations in the mixed major gene plus polygenes inheritance analysis of quantitative traits[J]. Journal of Biomathematics， 2002（3）： 363-368.

[8]王建康，蓋鈞鎰. 數量性狀主-多基因混合遺傳的P1、P2、F1、

F2和F2：3聯(lián)合分析方法[J]. 作物學報，1998（6）：15-23.

WANG J K， GAI J Y. Identification of major gene and polygene mixed inheritance model of quantitative traits by using joint analysis of P1、P2、F1、F2 and F2：3 generations[J]. Acta Agronomica Sinica， 1998（6）： 15-23.

[9]蓋鈞鎰，章元明，王建康. QTL混合遺傳模型擴展至2對主基因+多基因時的多世代聯(lián)合分析[J]. 作物學報，2000，26（4）：385-391.

GAI J Y， ZHANG Y M， WANG J K. A Joint analysis of multiple generations for QTL models extended to mixed two major genes plus polygene[J]. Acta Agronomica Sinica， 2000， 26（4）： 385-391.

[10]劉兵. 植物數量性狀分離分析Windows軟件包SEA的研制[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2013.

LIU B. SEA： a software package of segregation analysis of quantitative traits in plants[D]. Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2013.

[11]王冬，孫九哲，彭玉富，等. 不同品種（系）烤煙西柏三烯二醇代謝差異研究[J]. 中國煙草學報，2014，20（6）：63-69.

WANG D， SUN J Z， PENG Y F， ET AL. Metabolism differences of cembratrien-diols in different tobacco cultivars[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（6）： 63-69.