孫慶云，杜元杰，王躍，朱序理，周亮，曹金鳳，趙志明，郝桂敏

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，石家莊 050000)

染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體平衡易位、羅氏易位、倒位，夫婦一方或雙方攜帶染色體結(jié)構(gòu)異常時(shí)往往會(huì)發(fā)生反復(fù)的孕早期流產(chǎn)，給患者帶來很大的困擾。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(Preimplantation genetic test，PGT)是在胚胎植入著床之前對(duì)早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常以及某些單基因病的檢測(cè)，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低流產(chǎn)率，預(yù)防出生缺陷。對(duì)于患者而言，活檢囊胚的數(shù)量和質(zhì)量決定了其可移植囊胚的數(shù)量和最終的妊娠結(jié)局。有研究顯示，囊胚的整倍體率和囊胚的評(píng)估參數(shù)有一定的相關(guān)性，但結(jié)論不一[1-2]。如何在降低患者花費(fèi)的前提下最大限度的提高囊胚的利用率是我們面對(duì)的難題，本文對(duì)我中心因染色體結(jié)構(gòu)異常行PGT檢測(cè)的囊胚分別采用周期特征性分析、廣義評(píng)估方程GEE模型和分類決策樹模型來分析囊胚的整倍體率，以探討囊胚評(píng)估參數(shù)與其整倍體率的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年1月至2020年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科因夫婦雙方或一方染色體結(jié)構(gòu)異常行PGT的83例患者(共97個(gè)周期)為研究對(duì)象，對(duì)其所檢測(cè)囊胚的PGT數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析。將所有患者按照一般情況、周期基本情況以及活檢囊胚情況進(jìn)行逐層分組，比較各亞組囊胚的PGT檢測(cè)結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦雙方或一方染色體結(jié)構(gòu)異常行PGT的周期；(2)本周期至少有1枚可活檢囊胚；(3)書面簽署PGT知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因單基因病行PGT的周期；(2)夫婦一方或雙方染色體結(jié)構(gòu)異常但未行囊胚活檢的周期。

二、研究方法

1.體外受精與胚胎培養(yǎng)：所有患者采用我中心常規(guī)促排卵方案[3]，取卵日采用超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。所有周期采用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)方式授精，ICSI后置于卵裂期培養(yǎng)液(G-1plus，Vitrolife，瑞典)進(jìn)行常規(guī)胚胎培養(yǎng)及觀察，第3天(D3)觀察胚胎情況并將可利用胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液(G-2plus，Vitrolife，瑞典)繼續(xù)培養(yǎng)至D5或D6。

2.囊胚評(píng)級(jí)：囊胚評(píng)價(jià)采用Gardner囊胚評(píng)分系統(tǒng)[4]，根據(jù)囊胚擴(kuò)張和孵出程度將囊胚分為1～6期：1期為早期囊胚，囊胚腔體積小于囊胚的二分之一；2期囊胚的囊胚腔體積大于囊胚的二分之一；3期為完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚；4期為擴(kuò)張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明帶變?。?期為正在孵化的囊胚，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；6期為孵化出的囊胚，囊胚完全從透明帶中脫出。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblast cell，TE)評(píng)級(jí)根據(jù)細(xì)胞數(shù)目和緊湊程度評(píng)為A、B、C級(jí)：A級(jí)為細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密；B級(jí)為細(xì)胞數(shù)目較少，結(jié)合較松散；C級(jí)為細(xì)胞數(shù)目極少。

3.囊胚活檢：活檢囊胚標(biāo)準(zhǔn)：囊胚發(fā)育至D5、D6或D7，擴(kuò)張程度為3期及以上，囊胚ICM與TE評(píng)級(jí)不同時(shí)為C級(jí)?；顧z時(shí)使用激光在透明帶遠(yuǎn)離ICM的位置打孔，使用30 μm內(nèi)徑的活檢針吸取滋養(yǎng)層細(xì)胞5～10個(gè)，將活檢的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有2 μl PBS的PCR管內(nèi)，短暫離心后置于-20℃凍存待檢?；顧z后囊胚采用玻璃化冷凍方法(KITAZATO Vitrofaction KIT，加藤，日本)冷凍后置于液氮罐保存。

4.PGT檢測(cè)：活檢細(xì)胞樣本采用SurePlex DNA Amplification System試劑盒(Illumina，美國(guó))進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行文庫構(gòu)建及純化，然后通過MISEQ平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，pgxcloud分析系統(tǒng)進(jìn)行分析并比對(duì)hg19數(shù)據(jù)庫出具PGT報(bào)告，檢出范圍：23對(duì)染色體非整倍體、4 Mb及以上的片段缺失/重復(fù)、30%及以上的嵌合，其中片段缺失/重復(fù)以及嵌合體囊胚均按非整倍體計(jì)算[5]。

5.觀察指標(biāo)：記錄各組活檢囊胚的評(píng)估參數(shù)，分析囊胚的整倍體率與女方年齡、男方年齡、女方基礎(chǔ)FSH/LH比值、女方體重指數(shù)(BMI)、PGT指征、染色體結(jié)構(gòu)異常來源男方/女方、獲卵數(shù)、促排方案、Gn總量、活檢囊胚數(shù)以及囊胚活檢時(shí)的發(fā)育天數(shù)、囊胚擴(kuò)張程度、ICM級(jí)別、TE級(jí)別的相關(guān)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、活檢囊胚檢測(cè)結(jié)果

本次研究共納入83例患者(97個(gè)PGT周期)。共活檢371枚囊胚，其中整倍體囊胚154枚(41.51%)，非整倍體囊胚217枚(58.49%)。

二、活檢囊胚整倍體率單因素分析

1.患者基本情況與整倍體率：將所有患者按照一般情況逐層分組，研究結(jié)果顯示，女方18.5≤BMI<24 kg/m2組囊胚整倍體率(48.37%)顯著高于BMI<18.5 kg/m2組(23.81%)和BMI≥24 kg/m2組(36.44%)(P<0.05)；而女方年齡、男方年齡、女方基礎(chǔ)FSH/LH比值與囊胚整倍體率均無顯著相關(guān)性。

表1 活檢囊胚整倍體率單因素分析(%)

2.PGT指征與整倍體率：根據(jù)患者進(jìn)行PGT周期的指征進(jìn)行逐層分組，結(jié)果顯示：染色體結(jié)構(gòu)異常行PGT的周期中，平衡易位組囊胚整倍體率(31.88%)顯著低于羅氏易位組(52.85%)和倒位組(56.10%)(P<0.05)；而按性別不同將染色體結(jié)構(gòu)異常來源分成女方、男方兩組時(shí)，兩組囊胚整倍體率無顯著差異(P>0.05)。

3.促排卵周期與整倍體率：根據(jù)患者周期基本情況進(jìn)行逐層分組，結(jié)果顯示，促排周期中Gn總量<2 250 U組囊胚整倍體率(50.00%)顯著高于Gn總量2 250～3 000 U組(38.06%)和Gn總量>3 000 U組(34.15%)(P<0.05)；而促排卵方案、獲卵數(shù)、每周期可活檢囊胚個(gè)數(shù)與囊胚整倍體率均無顯著相關(guān)性(P<0.05)。

4.活檢囊胚情況與整倍體率：根據(jù)患者活檢囊胚情況進(jìn)行逐層分組，研究顯示，D5活檢囊胚的整倍體率(53.53%)顯著高于D6(31.96%)和D7(14.29%)(P<0.05)；囊胚的整倍體率隨活檢囊胚的擴(kuò)張程度升高呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；活檢囊胚的ICM評(píng)級(jí)為A級(jí)的囊胚整倍體率(67.74%)均顯著高于B級(jí)(39.02%)和C級(jí)(39.62%)(P<0.05)；活檢囊胚的TE評(píng)級(jí)為A級(jí)的囊胚整倍體率(70.00%)高于B級(jí)(46.98%)和C級(jí)(36.32%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、囊胚整倍體率相關(guān)因素的廣義評(píng)估方程GEE模型分析

納入女方年齡、男方年齡、女方BMI、基礎(chǔ)激素水平(FSH、LH、E2)、促排情況(Gn總量、Gn天數(shù))、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、染色體異常類型及來源、每周期活檢囊胚個(gè)數(shù)以及活檢囊胚的評(píng)估參數(shù)(發(fā)育天數(shù)、擴(kuò)張程度、ICM/TE評(píng)級(jí))等可能與囊胚整倍體率相關(guān)的因素進(jìn)行GEE模型分析。結(jié)果顯示，活檢囊胚發(fā)育天數(shù)及擴(kuò)張程度與囊胚整倍體率均具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，OR值分別為4.400[95%CI(1.553，12.465)]、0.344[95%CI(0.128，0.928)]；而女方年齡、男方年齡、女方BMI、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、基礎(chǔ)激素水平(FSH、LH、E2)、促排情況(Gn總量、Gn天數(shù))、囊胚ICM、TE評(píng)級(jí)均與其整倍體率無顯著相關(guān)性(P>0.05)(表2)。

表2 囊胚整倍體率相關(guān)因素的廣義評(píng)估方程GEE模型分析

四、SPSS分類決策樹模型

采用SPSS 22.0分類決策樹以整倍體率增加(生長(zhǎng)法)分析囊胚參數(shù)相關(guān)性指標(biāo)。指定項(xiàng)：以囊胚是否為整倍體為因變量；以PGT指征、染色體結(jié)構(gòu)異常來源于男方/女方、活檢囊胚發(fā)育天數(shù)、期別、ICM和TE評(píng)級(jí)作為自變量，女方年齡為影響變量，使用生長(zhǎng)法生成兩個(gè)分區(qū)；在每個(gè)分區(qū)中執(zhí)行相同的過程，直到?jīng)]有變量向樹添加值為止，結(jié)果顯示共生成3組節(jié)點(diǎn)：第1組節(jié)點(diǎn)為PGT指征：倒位及羅氏易位患者的整倍體率顯著高于平衡易位患者(χ2=19.164，P=0.000)(P<0.05)；第2組節(jié)點(diǎn)為囊胚發(fā)育天數(shù)，活檢時(shí)發(fā)育天數(shù)為D5的囊胚整倍體率顯著高于D6和D7囊胚(χ2=10.824，P=0.003)(P<0.05)；第3組節(jié)點(diǎn)為染色體結(jié)構(gòu)異常來源于男方/女方：在倒位及羅氏易位患者中，男方核型異常患者其囊胚整倍體率顯著高于女方核型異?；颊?χ2=5.552，P=0.018)(P<0.05)，但是在平衡易位患者中，女方核型異?；颊咂淠遗哒扼w率顯著高于男方核型異常患者(χ2=5.320，P=0.021)(P<0.05)，交叉驗(yàn)證正確百分比64.2%(圖1)。

討 論

隨著囊胚活檢和二代測(cè)序技術(shù)日趨成熟，很多染色體結(jié)構(gòu)異常的患者可以通過PGT技術(shù)得到整倍體的囊胚進(jìn)行移植，避免了反復(fù)流產(chǎn)和出生畸形兒的風(fēng)險(xiǎn)，但是PGT檢測(cè)費(fèi)用仍然相對(duì)較高，為了更好地提高患者的囊胚利用效率和節(jié)省費(fèi)用，活檢囊胚的選擇就顯得很重要。目前，各中心通常采用Gardner囊胚評(píng)分方法，囊胚發(fā)育天數(shù)、擴(kuò)張程度、ICM、TE這四者之間具有相對(duì)獨(dú)立性，而各參數(shù)與囊胚整倍體率的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道也存在爭(zhēng)議[5-7]。

本文使用3種分析方法即周期特征性分析、分類決策樹模型和廣義評(píng)估方程GEE模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。周期特征性分析是將周期各個(gè)指標(biāo)作為囊胚整倍體率的獨(dú)立因素，進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析或χ2檢驗(yàn)，簡(jiǎn)單易行，得出的數(shù)據(jù)比較直觀，但是這種統(tǒng)計(jì)方法忽略了各指標(biāo)之間的相互影響，忽略了本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)質(zhì)為重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的特性；分類決策樹模型實(shí)質(zhì)是從多個(gè)指標(biāo)中挖掘出有意義的指標(biāo)并按相關(guān)程度排序生成節(jié)點(diǎn)，得出的結(jié)論比較直觀，易于理解和解釋，可以清晰的看出哪些字段比較重要，但是在樣本量較少的情況下，有可能篩選排除掉一些有意義的指標(biāo)；廣義評(píng)估方程GEE模型是將囊胚數(shù)據(jù)屬于重復(fù)測(cè)量這一特性考慮其中，比如1名平衡易位的患者活檢了6枚囊胚，而另1名羅氏易位的患者活檢了2枚囊胚，這些囊胚并不是完全獨(dú)立的，GEE模型在分析的時(shí)候可以將不同患者之間的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并校正，這樣得出的結(jié)論才更有代表性。

ICM和TE評(píng)級(jí)與其整倍體率的相關(guān)性尚未確定，由于活檢操作是吸取TE，所以考慮TE與其整倍體率密切相關(guān)，但從生理學(xué)角度來看，TE和ICM并不是孤立存在的，而是作為一個(gè)有機(jī)整體共存具有相互作用的[8]。前期有些學(xué)者的研究結(jié)果也顯示囊胚的擴(kuò)張程度、ICM及TE評(píng)級(jí)均與其整倍體率相關(guān)，但這些指標(biāo)在提示囊胚的整倍體性的過程中重要性如何報(bào)道并不一致[9-11]。本研究周期特征性分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，ICM和TE的不同評(píng)級(jí)其整倍體率不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但廣義評(píng)估方程GEE模型和分類決策樹模型結(jié)果則顯示，ICM和TE評(píng)級(jí)與囊胚整倍體率無顯著相關(guān)性，考慮可能由于ICM和TE評(píng)級(jí)這兩個(gè)指標(biāo)并不能完全獨(dú)立。我們的活檢標(biāo)準(zhǔn)是ICM和TE不能同時(shí)為C級(jí)，所以有一項(xiàng)指標(biāo)為C級(jí)時(shí)另一個(gè)指標(biāo)必須為A或B級(jí)，這樣兩項(xiàng)評(píng)級(jí)就會(huì)相互影響；再者ICM和TE評(píng)級(jí)主觀性較強(qiáng)，這也可能會(huì)影響最終的分析結(jié)果，即便如此，從結(jié)果中我們也可以看到ICM和TE為A級(jí)的囊胚整倍體率是高于B、C級(jí)的。

相對(duì)于ICM和TE評(píng)級(jí)來說，對(duì)囊胚的發(fā)育天數(shù)和擴(kuò)張程度的評(píng)估是比較客觀的。囊胚發(fā)育速度被認(rèn)為是評(píng)估囊胚質(zhì)量的重要指標(biāo)，發(fā)育速度不同的囊胚整倍體率是否存在差異仍然存在爭(zhēng)議，Munné等[12]的研究認(rèn)為，不同中心由于促排卵方案以及培養(yǎng)體系的不同其囊胚的整倍體率也有所不同，但與培養(yǎng)天數(shù)無關(guān)。Kaing等[13]研究發(fā)現(xiàn)，D5活檢的囊胚其整倍體率顯著高于D6活檢的囊胚，而且Irani等[14]進(jìn)行回顧性分析結(jié)果顯示，移植D5囊胚的著床率及活產(chǎn)率均顯著高于D6囊胚。本研究3種分析方法結(jié)果都發(fā)現(xiàn)，發(fā)育天數(shù)D5囊胚的整倍體率顯著高于D6、D7囊胚，囊胚發(fā)育天數(shù)與其整倍體率具有顯著相關(guān)性；本研究只有GEE模型結(jié)果顯示囊胚擴(kuò)張程度與其整倍體率密切相關(guān)，5～6期囊胚整倍體率高于4期和3期囊胚，這與既往一致[15]。因?yàn)槟遗甙l(fā)育天數(shù)與擴(kuò)張程度共同體現(xiàn)了囊胚的發(fā)育速度，由此我們得出發(fā)育速度較快的囊胚整倍體率相對(duì)較高。

囊胚的整倍體率與患者染色體的異常類型密切相關(guān)，染色體平衡易位患者其囊胚整倍體率顯著低于羅氏易位患者[16]，這與不同的結(jié)構(gòu)異常其配子形成機(jī)制不同有關(guān)。比如染色體平衡易位患者在形成配子過程中共可產(chǎn)生18種類型的配子，其中1種完全正常，1種為攜帶，其余16種均為異常；而羅氏易位患者可產(chǎn)生6種類型的配子，其中1種完全正常，1種為攜帶，其余4種均為異常。有文獻(xiàn)報(bào)道，相互易位攜帶者的異常胚胎比例約為68%，羅氏易位攜帶者異常胚胎比例約為48%[17]，這是由于易位患者其每種配子產(chǎn)生的幾率并不完全一致，而且由于我們培養(yǎng)囊胚的過程中胚胎也經(jīng)過了優(yōu)勝劣汰，所以胚胎的整倍體率比理論上高的多。我們的周期特征性分析和分類決策樹模型都顯示染色體平衡易位患者囊胚的整倍體率顯著低于染色體羅氏易位患者和倒位患者。另一方面，男方或女方核型異常行PGT時(shí)，其囊胚整倍體率有無差別，文獻(xiàn)報(bào)道不一。Zhang等[18]的研究認(rèn)為，男性和女性相互易位攜帶者其減數(shù)分裂時(shí)四價(jià)體不同分離模式的發(fā)生率是不一致的，男性攜帶者鄰近-1模式分離顯著高于女性攜帶者，而女性攜帶者鄰近-2和3∶1模式分離顯著高于男性。Idowu等[19]報(bào)道，相互易位和羅氏易位患者行PGT檢測(cè)的結(jié)果顯示，女性攜帶者其囊胚發(fā)生易位相關(guān)的非整倍體率顯著高于男性攜帶者，但總體的囊胚非整倍體率在男性和女性攜帶者之間無顯著差異。國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)于易位攜帶者性別與囊胚整倍體率的相關(guān)性也不一致。肖卓妮等[20]研究結(jié)果顯示，相互易位男性攜帶者其囊胚整倍體率顯著高于女性攜帶者；而劉靜文等[21]則報(bào)道，染色體結(jié)構(gòu)異?；颊叩男詣e與囊胚整倍體率無顯著相關(guān)性。我們的研究中只有分類決策樹模型顯示囊胚整倍體率與染色體結(jié)構(gòu)異?；颊叩男詣e具有相關(guān)性。在羅氏易位和倒位患者中，男性核型異常的患者囊胚整倍體率較高，而在平衡易位患者中，女方核型異常的患者囊胚整倍體率較高。這與之前的報(bào)道并不一致，考慮可能由于羅氏易位、倒位與相互易位減數(shù)分裂的分離模式不同，不同分離模式的發(fā)生概率也不同，進(jìn)而導(dǎo)致最終囊胚整倍體率在男性和女性攜帶者之間產(chǎn)生了差別，這還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

我們的3種分析方法結(jié)果都顯示，女方年齡、男方年齡、女方基礎(chǔ)FSH、促排卵方案以及獲卵數(shù)和活檢囊胚數(shù)與其囊胚整倍體率均無顯著相關(guān)性。Marca等[22]報(bào)道，在行胚胎植入前非整倍體篩查的患者中，女方年齡增大其囊胚整倍體率下降；孫寶剛等[23]報(bào)道，在對(duì)D3廢棄胚胎進(jìn)行整倍體檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)男方年齡≥40歲時(shí)其胚胎整倍體率下降顯著。但這兩篇報(bào)道都是夫婦染色體正常行植入前非整倍體篩查的研究與我們所分析的染色體結(jié)構(gòu)異?；颊哂兴煌Ｎ覀兊臄?shù)據(jù)顯示，女方和男方年齡≥35歲時(shí)，囊胚整倍體率有下降趨勢(shì)，由于我中心染色體結(jié)構(gòu)異常患者多因?yàn)榉磸?fù)流產(chǎn)檢查而得知，這部分患者年齡普遍偏低，高齡的患者例數(shù)較少，所以差異不顯著，如需分析在結(jié)構(gòu)異常患者中年齡是否為相關(guān)因素還需加大樣本量進(jìn)一步研究。我們的周期特征性分析結(jié)果還提示，女方BMI和促排的Gn總量與其囊胚整倍體率相關(guān)，BMI偏高或偏低都會(huì)使其囊胚整倍體率降低，使用Gn總量較少的患者其囊胚整倍體率較高，但分類決策樹模型與廣義評(píng)估方程GEE模型結(jié)果顯示女方BMI和促排的Gn總量與其囊胚整倍體率沒有顯著相關(guān)性，所以考慮這兩個(gè)指標(biāo)為混雜因素，在校正之后結(jié)果顯示并不是影響囊胚整倍體率的相關(guān)因素。張晉寧等[24]也報(bào)道，Gn的累積使用量以及促排卵方案與其囊胚的整倍體率沒有顯著相關(guān)性。

綜上所述，PGT周期進(jìn)行囊胚活檢時(shí)，建議優(yōu)先考慮囊胚的發(fā)育天數(shù)。D5活檢囊胚的整倍體率最高，而D7囊胚的整倍體率僅約14%。也有報(bào)道雖然D7囊胚整倍體率較低但其種植率與D5、D6相差不大[25]，認(rèn)為不應(yīng)輕易放棄，這時(shí)候我們就要綜合患者的經(jīng)濟(jì)情況決定是否進(jìn)行D7囊胚的非整倍體檢測(cè)；其次應(yīng)考慮囊胚的擴(kuò)張程度，這也是囊胚發(fā)育速度的一個(gè)重要指標(biāo)；ICM和TE等級(jí)也是我們應(yīng)該考慮的因素，這兩個(gè)指標(biāo)直接關(guān)系到冷凍解凍的復(fù)蘇率和復(fù)蘇后囊胚移植的妊娠率。因此，我們應(yīng)建立適當(dāng)?shù)幕顧z囊胚標(biāo)準(zhǔn)，提高患者囊胚利用率，提高患者的經(jīng)濟(jì)效益，縮短獲得妊娠的時(shí)間。