宮頸癌是一種發(fā)于子宮頸部的婦科常見惡性腫瘤，多發(fā)于40～60歲女性群體，其病死率高居婦科腫瘤第二。由于病毒感染、生活習慣、性行為、妊娠、分娩、經(jīng)濟條件等影響，我國宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢。雖然近年來關于宮頸癌相關研究較多，但病人病死率仍處于較高水平，早期有效診斷有助于提高宮頸癌治療效果和改善病人預后。人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染與宮頸癌密切相關，經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV之一的人乳頭瘤病毒16型（HPV16）感染是我國宮頸癌發(fā)生的主要影響因素。Hong等研究表明，高水平的HPV16載量預示宮頸癌惡性程度加深。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著HPV16陽性率升高，宮頸癌病人的國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期升高、病死率增大。有研究報道，微小RNA-145（Micro ribonucleic acid-145，miR-145）在非小細胞肺癌細胞系中表達下調(diào)，過表達miR-145可能通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程抑制癌細胞遷移和入侵，發(fā)揮抑癌作用。段亞男等研究報道，肺腺癌病人血清miR-145表達水平明顯降低，與TNM分期、病理分級、淋巴結轉(zhuǎn)移等密切相關。由于宮頸癌血清中miR-145與宮頸脫落細胞HPV關系未見報道，本研究通過檢測宮頸癌病人血清miR-145表達水平，分析與病人臨床病理特征及HPV感染關系，探究其對宮頸癌診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2019年5月三亞市中醫(yī)院收治的宮頸癌病人83例，年齡范圍為37～78歲，年齡（51.34±16.18）歲。納入標準：①經(jīng)病理切片及臨床診斷，確診為宮頸癌。②均為首次患癌，且臨床及病理資料完整。③入組前未進行放、化療及藥物治療。④病人及其近親屬同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并患有其他部位腫瘤。②患有其他生殖系統(tǒng)疾病。③合并患有高血壓、糖尿病者。④妊娠期或哺乳期病人。根據(jù)FIGO分期系統(tǒng)，將入組病人分為：鱗癌47例，腺癌36例；根據(jù)腫瘤直徑分為：＜4 cm 34例，≥4 cm 49例；根據(jù)分化程度分為：高、中分化40例，低分化43例；根據(jù)間質(zhì)浸潤深度分為＜1/2 45例，≥1/2 38例；根據(jù)是否發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移分為：無淋巴結轉(zhuǎn)移72例，有淋巴結轉(zhuǎn)移11例。另選取同期在該院體檢顯示健康者83例為對照組，對照組對本研究知情并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 主要儀器和試劑

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRTPCR）儀（型號7900，美國Applied Biosystems公司）、普通PCR儀（型號GT9612，無錫百泰克生物技術有限公司）、電泳儀（型號1658001，美國伯樂公司）、qRT-PCR試劑盒（批號RR820A，寶日醫(yī)生物技術有限公司）、多重PCR試劑盒（批號N555-KIT，美國Amresco公司）、RNA提取試劑盒（批號R1200-100，北京索萊寶科技有限公司）、DNA提取試劑盒（批號D3892-02，美國Omega公司）。

1.3 方法

1.3.1

樣本采集 所有入組者于入院時清晨（7：00—9：00）空腹采集外周靜脈血5 mL，4℃、3 000 r/min條件下離心20 min后收集上清液，分裝于無菌EP管中，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

所有入組者于宮頸脫落細胞檢查時，使用宮頸刷采集宮頸脫落細胞，置于pH 7.0的PBS緩沖液中靜置后，在4℃、3 000 r/min條件下離心20 min富集細胞，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3.2

miR-145、人乳頭瘤病毒16型E6蛋白（HPV16 E6）mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR檢測所有入組者血清miR-145及宮頸脫落細胞HPV16 E6 mRNA表達水平。使用RNA提取試劑盒（Trizol法）提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，所得互補DNA（cDNA）用于qRT-PCR實驗。qRT-PCR反應體系（20μL）如下：cDNA 2μL，正、反向引物各0.8μL，反應混合物（Mix）10μL，熒光基團（ROX）0.4μL，無酶水6.0μL。具體反應步驟如下：95℃、36 s，1循環(huán)；95℃、5 s；62℃、34 s，40循環(huán)。每個樣本重復3次，用2法計算血清miR-145和宮頸脫落細胞HPV16 E6 mRNA表達水平。qRTPCR實驗所用引物如表1所示。

1.3.3

HPV16感染水平檢測 采用多重PCR技術檢測HPV16 E6 DNA表達水平。使用DNA提取試劑盒和PCR試劑盒提取宮頸脫落細胞DNA并進行PCR實驗，所得產(chǎn)物進行凝膠電泳成像。若HPV16 E6 DNA為陽性則判定HPV16為陽性。

表1 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物序列

2 結果

2.1 兩組一般資料對比

兩組年齡、已婚比例、懷孕次數(shù)＞2比例、絕經(jīng)比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。宮頸癌組病人流產(chǎn)次數(shù)＞1比例顯著高于對照組（

P

＜0.05）。見表2。

2.2 兩組血清miR

-

145及宮頸脫落細胞HPV16感染水平比較

宮頸癌組血清miR-145水平顯著低于對照組（

P

＜0.05），宮頸脫落細胞HPV16陽性率及HPV16 E6 mRNA表達水平明顯高于對照組（

P

＜0.05），見表3。

表3 健康體檢者與宮頸癌血清miR-145水平及人乳頭瘤病毒16型（HPV16）感染水平比較

2.3 血清miR

-

145水平與宮頸癌病人臨床病理特征關系

年齡、病理類型、腫瘤直徑、間質(zhì)浸潤深度與病人血清miR-145水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。不同分化程度病人血清miR-145水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。FIGO分期Ⅲ/Ⅵ期、有淋巴結轉(zhuǎn)移、HPV16陽性病人血清miR-145水平明顯低于FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期、無淋巴結轉(zhuǎn)移、HPV16陰性病人（

P

＜0.05）。見表4。

表4 宮頸癌83例血清miR-145水平與臨床病理特征關系/±s

2.4 宮頸癌病人血清miR

-

145與HPV16 E6 mRNA表達水平相關性

如圖1所示，宮頸癌病人血清miR-145與宮頸脫落細胞中HPV16 E6 mRNA表達水平呈負相關（

r

=-0.372，

P

=0.001）。

2.5 影響宮頸癌發(fā)生危險因素分析

以年齡、絕經(jīng)、懷孕次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、HPV16水平、miR-145水平為自變量，以宮頸癌是否發(fā)生為因變量建立非條件logistic回歸模型，賦值1=發(fā)生，0=未發(fā)生，檢驗水準為

α

=0.05。logistic回歸分析結果顯示，年齡≥51、絕經(jīng)、懷孕次數(shù)＞2與宮頸癌發(fā)生無關（

P

＞0.05）。流產(chǎn)次數(shù)＞1、HPV16陽性、miR-145低表達是影響宮頸癌發(fā)生的獨立危險因素（

P

＜0.05）。見表5。

表2 健康體檢者與宮頸癌一般資料對比

圖1 宮頸癌83例miR-145與人乳頭瘤病毒16型E6蛋白（HPV16 E6）mRNA表達水平相關性

2.6 miR

-

145對宮頸癌診斷價值

ROC曲線分析顯示，miR-145預測宮頸癌發(fā)生的曲線下面積為0.887，靈敏度為85.50%，特異度為86.70%，見圖2。

圖2 miR-145對宮頸癌83例診斷效能

3 討論

宮頸癌病人早期無明顯癥狀，可能出現(xiàn)輕微陰道出血、陰道排液和性交痛等，只能通過臨床檢測診出。但多數(shù)病人由于篩查不及時而使病情進展至中晚期，主要癥狀有不規(guī)則陰道出血、排液、下肢腫痛，引起其他器官病變?nèi)缒蚨景Y等，生存率極低。早期診斷可使病人進行及時有效治療，提高生存率和生活質(zhì)量。有研究報道，吸煙、被動吸煙、人工流產(chǎn)次數(shù)增加、過早生育等因素可能增加宮頸癌發(fā)生風險。本研究結果顯示，宮頸癌組病人流產(chǎn)次數(shù)＞1比例顯著高于對照組，提示流產(chǎn)次數(shù)增加可能影響宮頸癌發(fā)生。

HPV是一種環(huán)狀DNA病毒，有8個開放閱讀框，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。HPV與多種人類生殖系統(tǒng)感染類疾病有關。HPV16屬于高危型HPV，參與宮頸炎、子宮肌瘤、宮頸癌等疾病進展。有研究表明，宮頸脫落細胞中HPV16檢出率隨病變程度提高而升高。本研究結果顯示，宮頸癌病人宮頸脫落細胞HPV16陽性率明顯高于對照組，提示HPV16可能與宮頸癌發(fā)生有關。Baedyananda等研究報道，HPV16靶蛋白E1在宮頸癌組織中表達水平升高，與疾病進展密切相關，可能作為宮頸癌預后標志物。有研究證實，HPV E6在人宮頸角化細胞致瘤轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，宮頸癌病人宮頸脫落細胞HPV16 E6 mRNA表達水平明顯高于對照組，提示HPV16可能通過影響癌細胞增殖，影響宮頸癌發(fā)展。

微小RNA是一類具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA，與疾病進展有關。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)，miR-1225在胰腺癌細胞中表達下調(diào)，miR-1225過表達增加了胰腺癌細胞凋亡。Tan等研究報道，乳腺癌細胞中miR-708表達水平降低，與病人化療反應和預后不良有關，在癌細胞自我更新和耐藥中發(fā)揮抑癌作用。提示miRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。有研究報道，miR-145在宮頸癌中表達水平低于正常組織，與FIGO分期晚期、淋巴結轉(zhuǎn)移和病人生存率低有關，可能是宮頸癌潛在預后標志物。本研究結果顯示，miR-145在宮頸癌病人血清中表達水平顯著低于對照組，且與腫瘤分化程度、FIGO分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關，與Azizmohammadi等研究結果一致，提示miR-145可能與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關。Yin等研究證實，miR-145可能通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）蛋白表達，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少非小細胞癌細胞遷移和侵襲，抑制腫瘤形成。提示miR-145可能通過影響TGF-β誘導的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與宮頸癌進展。

表5 宮頸癌發(fā)生危險因素的166例logistic回歸分析

Tao等研究報道，口咽鱗狀細胞癌中TGF-β可能通過調(diào)控HPV16水平，影響癌癥發(fā)生風險。Liu等在非小細胞肺癌研究中表明，HPV16 E6蛋白在癌細胞中通過上調(diào)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化水平，促進癌癥發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16陽性病人血清miR-145水平明顯低于HPV16陰性病人，且宮頸癌病人血清miR-145與宮頸脫落細胞HPV16 E6 mRNA表達水平呈正相關，提示miR-145可能通過TGF-β調(diào)控HPV16水平，影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進宮頸癌發(fā)生發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)次數(shù)＞1、HPV16陽性、miR-145低表達是影響宮頸癌發(fā)生獨立危險因素，且miR-145預測宮頸癌發(fā)生的曲線下面積為0.887，靈敏度為85.50%，特異度為86.70%，診斷價值較高。進一步提示miR-145低表達可能作為早期宮頸癌診斷標志物，為臨床診治宮頸癌提供一定幫助。

綜上所述，與對照組相比，宮頸癌組血清miR-145水平顯著降低，宮頸脫落細胞HPV16陽性率及HPV16 E6 mRNA表達水平顯著升高，miR-145可能與HPV16相互作用，共同影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展。但由于本研究樣本量較少，研究較為基礎，具體機制尚需進行大量實驗進一步驗證。