冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)是一種常見心血管疾病,好發(fā)于中老年人群,隨著現(xiàn)代生活方式的改變,該病發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為人類致死率最高的疾病之一。微小RNA(microRNA,miRNA)是非編碼內(nèi)源性小分子RNA,長度約為22~25個核苷酸,參與諸多腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展及細胞增殖凋亡等生物進程。據(jù)報道,miRNAs表達水平變化與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn),miRNA不僅僅是一種生物標志物,還可能是引起冠心病的又一危險分子。Gensini積分是目前公認的可全面反映冠心病血管病變嚴重程度的量化指標。目前,國內(nèi)外關(guān)于miR-33、miR-122水平與冠心病病人Gensini積分的相關(guān)性分析研究較少。本研究通過觀察冠心病病人血清miR-33、miR-122水平及Gensini積分,并分析其相關(guān)性?,F(xiàn)報告如下。
1.1 一般資料
隨機抽簽法選取2014年1月至2015年12月在南陽市第一人民醫(yī)院做冠脈造影術(shù)的冠心病病人200例為冠心病組,男性96例,女性104例,年齡45~75歲,平均年齡(54.69±7.61)歲;對照組120例,男性63例,女性57例,年齡46~77歲,平均年齡(54.32±7.85)歲。本研究中樣品的采集獲得病人、近親屬的知情同意,符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。1.2 選取標準
納入標準:①冠脈造影術(shù)顯示至少一支冠脈血管狹窄≥50%者;②所有調(diào)查研究均自愿且經(jīng)病人及其近親屬同意,并簽字確認;③年齡均≥40歲。排除標準:①患有惡性腫瘤、嚴重肝臟、腎臟等臟器功能不全、自身免疫性疾病者;②精神狀態(tài)異常、生活不能自理者;③伴有心肌梗死、心臟瓣膜病、慢性心肌炎、急性心肌炎、心包炎、先天性心臟病等病人;④患有肺動脈栓塞、結(jié)締組織病者。1.3 方法
1.3.1
主要試劑及儀器 Trizol試劑(DP424)購于天根生化科技有限公司;AceQ qPCR SYBR? Green Mix(貨號Q111-02)購于南京vazyme公司;miR-33、miR-122及內(nèi)參U6引物由上海生工生物公司合成。紫外分光光度計(型號ND-2000C)購于美國Thermo公司、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)儀(型號T100)購于美國Bio-Rad公司。1.3.2
qRT-PCR檢測血清miR-33、miR-122水平采集受試者晨起空腹靜脈血約5 mL,常溫離心10 min(3 500 r/min),收集血清-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。采用Trizol試劑提取受試者血清中的總RNA并通過紫外分光光度計測定其中RNA的濃度和純度。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到互補DNA(cDNA),采用qRT-PCR檢測受試者血清中miR-33、miR-122的相對表達量。反應(yīng)體系:10μL miScript SYBR?Green Mix,1μL cDNA(50 mg/L),0.5μL正向、反向引物(10μM),8.0μL雙蒸水(ddH2O)。反應(yīng)條件(40個循環(huán)):95℃(90 s);95℃(30 s);63℃(30 s);72℃(15 s)。miR-33、miR-122、內(nèi)參U6的引物序列見表1。采用2法分析受試者血清中miR-33、miR-122的相對表達水平。1.3.3
Gensini積分計算標準 冠脈造影檢查及Gensini積分由該院資深心內(nèi)科醫(yī)師完成,Gensini積分標準參考美國心臟協(xié)會規(guī)定的冠脈血管圖像分段評價標準Gensini積分系統(tǒng):根據(jù)冠狀動脈狹窄程度進行評分:正常,0分;≤25%,1分;26%~50%,2分;51%~75%,4分;76%~90%,8分;91%~99%,16分;100%,32分。系數(shù)根據(jù)不同狹窄部位確定:左主干,系數(shù)為5;左前降支近段,系數(shù)為2.5,中段,系數(shù)為1.5,遠段,系數(shù)為1.0;第一對角支,系數(shù)為1.0,第二對角支,系數(shù)為0.5;回旋支近段,系數(shù)為2.5,中段,系數(shù)為1.5,遠段,系數(shù)為1.0;后降支,系數(shù)為1.0;后側(cè)支,系數(shù)為0.5;右冠近、中、遠后降支,系數(shù)為1.0。根據(jù)冠心病的病變支數(shù)分組:單支組(回旋支、前降支、右冠任1支發(fā)生病變,血管狹窄≥50%);2支組(回旋支、前降支、右冠任2支有病變,左主干病變屬2支組,至少1支血管狹窄≥70%);3支組(回旋支、前降支、右冠均發(fā)生病變,至少1支血管狹窄≥90%)。按照公式計算Gensini積分=(單處病變狹窄程度積分×相應(yīng)系數(shù))×總支數(shù)。表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)引物序列
2.1 對照組、冠心病組病人一般資料比較
與對照組相比,冠心病組病人年齡、性別、腰臀比、血清肌酐異常比例和冠心病家族史比例均差異無統(tǒng)計學意義(P
>0.05),吸煙比例、高血壓病史比例、糖尿病病史比例、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇(LDL)水平顯著較高(P
<0.05)。見表2。表2 冠心病組和對照組病人一般臨床資料比較
2.2 對照組、冠心病組病人血清中miR
-33、miR
-122水平比較
與對照組相比,冠心病組病人血清中miR-33、miR-122水平顯著升高(P
<0.05)。見表3。表3 冠心病組和對照組血清miR-33、miR-122水平比較/±s
2.3 冠心病組各亞組血清中miR
-33、miR
-122水平及Gensini積分比較
2支組、3支組miR-33、miR-122水平及Gensini積分均較單支組顯著升高(P
<0.001);與2支組相比,3支組miR-33、miR-122水平及Gensini積分顯著升高(P
<0.001)。詳見表4。表4 冠心病組中各亞組血清中miR-33、miR-122水平及Gensini積分比較/±s
2.4 冠心病各亞組病人血清中miR
-33、miR
-122水平與Gensini積分的相關(guān)性分析
Pearson分析結(jié)果顯示,miR-33水平和Gensini積分呈正相關(guān)(r
=0.706,P
<0.001);miR-122水平和Gensini積分呈正相關(guān)(r
=0.458,P
<0.001)。2.5 logistic回歸分析冠心病的危險因素
為了確定冠心病的危險因素,以冠心病年齡、性別、腰臀比、血清肌酐異常和冠心病家族史、吸煙、高血壓病史、糖尿病病史、三酰甘油、LDL含量、血清miR-33、miR-122水平為自變量進行多因素logistic回歸分析,結(jié)果顯示LDL含量、miR-33、miR-122水平及年齡是冠心病的獨立危險因素(OR
=1.862,95%CI
:1.359~2.57;OR
=4.157,95%CI
:2.597~6.654;OR
=4.196,95%CI
:2.362~7.453,OR
=1.824,95%CI
:1.213~2.454)。詳見圖1。圖1 影響冠心病發(fā)生的危險因素分析森林圖
冠心病是一種常見的心血管疾病,是以動脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)導(dǎo)致冠狀動脈狹窄的一種疾病,該病涉及血管內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖遷移及炎性介質(zhì)釋放等慢性病變過程。據(jù)不完全統(tǒng)計,我國每年因疾病死亡病人中冠心病病人約占50%,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢,目前已經(jīng)成為危害我國居民健康的第2殺手。因此,加強冠心病預(yù)防、豐富早期診斷方法、提高治療成功率為現(xiàn)階段研究熱點。miRNA是一種內(nèi)源性小RNA,在進化過程中高度保守,且可穩(wěn)定存在于血清或血漿等多種液體中,主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達參與機體的各種生理、病理過程,并與冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。因此本實驗擬探究miR-33、miR-122水平與冠心病Gensini積分的相關(guān)性,以期為冠心病的早期診斷提供一定有價值的理論參考。
本研究發(fā)現(xiàn),冠心病組病人在吸煙比例、高血壓病史比例、糖尿病病史比例、三酰甘油及LDL水平顯著高于對照組,提示冠心病的發(fā)生可能與生活習慣有關(guān),不良生活習慣可能增加冠心病發(fā)生風險。進一步研究結(jié)果顯示,冠心病組病人血清中miR-33、miR-122水平均顯著高于對照組,且隨著冠心病血管病變支數(shù)增多,miR-33、miR-122水平依次升高。miR-33存在于大多數(shù)組織中,其基因序列和位置均高度保守,主要包含兩個亞型,miR-33a和miR-33b。研究表明,miR-33可以影響固醇合成和脂肪β氧化以及脂質(zhì)代謝過程,上調(diào)miR-33a表達,血漿膽固醇含量會增加,抑制miR-33表達,血漿中膽固醇含量降低,HDL含量顯著增加,動脈粥樣硬化程度會減弱。有研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-33可促進冠心病的發(fā)生發(fā)展,miR-33可能成為冠心病發(fā)生發(fā)展的一個生物標志物。miR-122是一種在成年人肝臟細胞中高度表達的miRNA,研究表明,腺病毒高表達miR-122會增加肝臟中合成膽固醇基因如Mmgrcs1、Dhcr7等表達,抑制miR-122表達后,會影響肝臟功能,使膽固醇合成效率降低。膽固醇的合成代謝與冠心病以及其他心血管疾病密切相關(guān)。綜合以上研究及本研究結(jié)果,提示冠心病病人血清miR-33、miR-122高表達與病人病情發(fā)展有關(guān)。
研究發(fā)現(xiàn),miR-181b在冠心病病人血漿中低表達,與Gensini積分呈負相關(guān),具有抗動脈粥樣硬化作用;miR-130a在冠心病病人血漿中高表達,與Gensini積分呈正相關(guān)關(guān)系,發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用。miR-21可通過抵抗缺血引起的心肌死亡發(fā)揮心肌保護作用,在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。以上研究提示,多種miRNA表達可能參與冠心病發(fā)生發(fā)展。研究顯示,miR-33與Gensini積分呈正相關(guān)關(guān)系,可促進冠心病的發(fā)生發(fā)展進程。本研究結(jié)果顯示,miR-33、miR-122在冠心病病人血清中均高表達,且與病人Gensini積分呈正相關(guān),提示血清miR-33、miR-122水平可能與冠心病病人嚴重程度有關(guān)。logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-33、miR-122水平升高、LDL含量增多以及年齡均為冠心病發(fā)生的獨立危險因素,提示miR-33、miR-122高表達與冠心病發(fā)生有關(guān)。
綜上所述,冠心病病人血清中miR-33、miR-122表達水平均顯著上調(diào),且與Gensini積分正相關(guān),是影響冠心病發(fā)生的危險因素,推測檢測血清miR-33、miR-122水平可能作為評估冠心病病人病情的指標,其具體機制有待進一步研究。