骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的骨骼疾病，病人骨骼脆弱，有更高的骨折風(fēng)險(xiǎn)。骨質(zhì)疏松癥給世界許多國(guó)家或地區(qū)的醫(yī)療保健系統(tǒng)造成了沉重且日益增加的負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松性骨折病人的生活質(zhì)量降低、病死率升高，并且需占用大量的醫(yī)療資源。同時(shí)，骨質(zhì)疏松會(huì)降低骨折愈合過(guò)程中骨痂的生物力學(xué)特性，因此，骨質(zhì)疏松性骨折愈合過(guò)程的生物力學(xué)特征和正常骨折不盡相同。。引起繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的原因有許多，其中主要因素還是年齡增長(zhǎng)。骨質(zhì)疏松大大影響了老年人的日常生活活動(dòng)，骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的預(yù)防及治療仍是當(dāng)前的一大難題。近年來(lái)，盡管包括抗再吸收藥物及合成代謝藥物在內(nèi)的幾種藥物已取得不錯(cuò)進(jìn)展，但是骨質(zhì)疏松性骨折的臨床療效仍然有待提高。開(kāi)發(fā)新的治療方法以及加快正常的骨修復(fù)過(guò)程仍是目前骨折治療的主要挑戰(zhàn)。

microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小型單鏈非編碼RNA，它們?cè)谡婧松镏袕V泛表達(dá)。miRNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用，可參與多種代謝疾病的調(diào)控，包括骨質(zhì)疏松。同時(shí)，在骨代謝中，miRNA與骨形成、吸收、重塑和成骨細(xì)胞分化等密切相關(guān)。越來(lái)越多的文獻(xiàn)指出miRNA可作為調(diào)控骨折修復(fù)的關(guān)鍵分子。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p、miR-140-5p、miR-181a-5p、miR-181d-5p和miR-451a在骨折修復(fù)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-367表達(dá)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖，進(jìn)而促進(jìn)骨折修復(fù)。但是miR-125a-3p在骨質(zhì)疏松性骨折修復(fù)方面的作用尚未明確。經(jīng)生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org）預(yù)測(cè)，miR-125a-3p可與Notch1靶向結(jié)合。Notch通路對(duì)組織重生，骨骼發(fā)育與骨重塑至關(guān)重要，其異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致一系列的骨骼疾病。綜上所述，本研究于2018年9月至2019年6月通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)，就miR-125a-3p在骨質(zhì)疏松性骨折中的作用展開(kāi)了研究。

1 材料與方法

1.1 骨質(zhì)疏松骨折大鼠模型的建立

1.1.1

大鼠的飼養(yǎng) 6月齡Wistar雌性大鼠58只，體質(zhì)量范圍為250～300 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物公司［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2018-004］。置于恒溫恒濕環(huán)境中，明12 h，暗12 h。標(biāo)準(zhǔn)固體飼料，飲用無(wú)菌水。所有老鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分組，假手術(shù)組8只，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M50只。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2

骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立 所有老鼠手術(shù)前禁飲食6 h，在用10%水合氯醛按3 mL/kg進(jìn)行腹腔麻醉。無(wú)菌條件下，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M經(jīng)背部進(jìn)入切除雙側(cè)卵巢后立即縫合傷口；假手術(shù)組前期步驟相同，但不切除卵巢，僅切除卵巢附近同等重量脂肪。自由飲食，正常飼養(yǎng)3個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組中按照隨機(jī)數(shù)字表法選取8只與假手術(shù)組8只在再次麻醉作用后進(jìn)行骨密度測(cè)定，驗(yàn)證骨質(zhì)疏松模型是否成立。

1.1.3

骨質(zhì)疏松骨折大鼠模型的建立 選取骨質(zhì)疏松模型成立大鼠40只，再次禁食6 h，同上述條件麻醉大鼠，隨機(jī)選取大鼠一側(cè)股骨，去毛干凈，0.5%碘伏消毒。股骨中點(diǎn)外側(cè)縱行切口，小鋼鋸鋸斷股骨，克氏針?biāo)鑳?nèi)固定，依次縫合傷口。

1.2 大鼠體內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)染

模型組老鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組（

n

=8）：模型組、inhibitor NC組（轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對(duì)照組）、miR-125a-3p inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-125a-3p抑制劑）、si-Notch1組（轉(zhuǎn)染Notch si-RNA干擾）、miR-125a-3p inhibitor+si-Notch1組（miR-125a-3p抑制劑及Notch1 si-RNA聯(lián)用組）。miR-125a-3p inhibitor、inhibitor NC、si-Notch1核酸序列均有廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染采用英格恩動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑（Entranster-in vivo，186658-11，北京）。骨折手術(shù)1個(gè)星期后，每只老鼠皮下注射100μL核酸溶液（均5μg核酸溶于100μL轉(zhuǎn)染試劑），每周1次，連續(xù)4周。轉(zhuǎn)染完成8周后繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站http：//www.targetscan.org預(yù)測(cè)miR-125a-3p與Notch1的結(jié)合位點(diǎn)后，再用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125a-3p對(duì)Notch1的靶向調(diào)節(jié)作用。將Notch1基因3"非翻譯區(qū)（UTR）端野生型（WT）及突變型（Mut）質(zhì)?？寺〉诫p熒光報(bào)告質(zhì)粒中（Promega，美國(guó)），然后分別與miR-125a-3p mimic及miR-NC（合成并購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司）共轉(zhuǎn)染至H293T細(xì)胞（購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)）中，海腎熒光素酶作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒dual-luciferase reporter assay system（Promega，美國(guó)）檢測(cè)熒光活性，以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性作為相對(duì)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT

-

PCR）檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

取各組大鼠股骨斷端組織標(biāo)本100 mg，加入1mL Trizol（Invitrogen，美國(guó)，貨號(hào)15596026），組織勻漿后按說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度，備用。取2μg的RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit（RR047A，Takara，Japan）說(shuō)明書(shū)操作，將mRNA逆轉(zhuǎn)成互補(bǔ)DNA（cDNA）。本實(shí)驗(yàn)所有引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成（表1），miR-125a-3p以U6為內(nèi)參，Notch1以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)設(shè)定條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火20 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。2表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系，計(jì)算細(xì)胞中各基因的表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）引物序列表

1.5 病理組織及免疫組化分析

轉(zhuǎn)染8周后，測(cè)完骨密度測(cè)定后，每組取4只大鼠，斷頸處死。去除股骨肌肉組織，拔掉克氏針，取骨折斷端組織，鹽水沖洗后常規(guī)固定、脫鈣、脫水、包埋切片，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化分析。

病理組織學(xué)觀察：石蠟包埋切片（5μm），二甲苯脫蠟，后用蘇木素和伊紅染色，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片，在顯微鏡下觀察骨組織的病理變化。

免疫組化分析：首先，脫蠟、水化組織切片，進(jìn)行抗原修復(fù)。接著3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，10%山羊血清封閉10 min，滴加BMP-2一抗（ab6285，Abcam，英國(guó)），4℃孵育24 h。PBS洗滌后滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，于顯微鏡下觀察，棕褐色的骨細(xì)胞為BMP-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。每組選取15張切片，每張隨機(jī)選一個(gè)視野，采用Image-Pro Plus分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞吸光度值。

1.6 骨密度檢測(cè)

轉(zhuǎn)染2、4、6、8周后的每組8只老鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法取4只，采用美國(guó)GE公司Lunar prodigy雙能X線(xiàn)骨密度儀，采用小動(dòng)物掃描模式，掃描術(shù)側(cè)股骨，測(cè)定骨痂骨密度。

1.7 生物力學(xué)測(cè)定

每組選剩余4只大鼠術(shù)側(cè)股骨，去除肌肉等軟組織、拔掉克氏針，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)量股骨力學(xué)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型中miR

-

125a

-

3p表達(dá)上調(diào)，Notch1表達(dá)下調(diào)

大鼠股骨骨密度測(cè)定檢測(cè)判斷骨質(zhì)疏松模型是否成立，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組較假手術(shù)組骨密度明顯下降（

P

＜0.05），說(shuō)明模型建立成功。qRT-PCR檢測(cè)假手術(shù)組及模型組中miR-125a-3p及Notch1表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中miR-125a-3p表達(dá)量均顯著上調(diào)，Notch1表達(dá)下調(diào)（均

P

＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 miR-125a-3p及Notch1基因在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠中的表達(dá)/±s

2.2 miR

-

125a

-

3p與Notch1具有靶向結(jié)合關(guān)系

Target Scan網(wǎng)站顯示miR-125a-3p和Notch1具有靶向結(jié)合關(guān)系。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-125a-3p mimic與突變型Notch1-Mut共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性強(qiáng)度無(wú)明顯改變（

P

＞0.05），與野生型Notch1-WT共轉(zhuǎn)染組中熒光素酶活性強(qiáng)度明顯下降（

P

＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明miR-125a-3p可以靶向調(diào)控Notch1基因的表達(dá)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-125a-3p與Notch1之間的靶向關(guān)系/±s

2.3 干擾miR

-

125a

-

3p及Notch1表達(dá)后其在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠中的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步研究miR-125a-3p對(duì)Notch1的調(diào)控，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組中miR-125a-3p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，模型組與inhibitor NC組、si-Notch1之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；與inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組及miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組表達(dá)明顯下調(diào)（

P

＜0.05）。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組中Notch1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與模型組與inhibitor NC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；與inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組Notch1表達(dá)顯著提高，si-Notch1組表達(dá)顯著降低（

P

＜0.05）。與si-Notch1組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組Notch1表達(dá)顯著提高（

P

＜0.05）。見(jiàn)表4。

上述結(jié)果說(shuō)明miR-125a-3p抑制及Notc1干擾轉(zhuǎn)染效率良好，且進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-125a-3p可靶向負(fù)調(diào)控Notch1的表達(dá)。

表4 miR-125a-3p及Notch1在基因水平的表達(dá)情況/±s

2.4抑制miR

-

125a

-

3p或干擾Notch1表達(dá)后HE染色分析

轉(zhuǎn)染8周后，組織學(xué)觀察顯示，假手術(shù)組骨小梁開(kāi)始大量形成，厚度均勻，排列緊密、方向一致。模型組、inhibitor NC組骨細(xì)胞數(shù)大量減少，骨小梁較細(xì)，間隙較大且排列紊亂。miR-125a-3p inhibitor組骨小梁厚度明顯增加，骨細(xì)胞數(shù)增多，骨質(zhì)改善，與假手術(shù)組顯微形態(tài)較為相似。si-Notch組骨細(xì)胞數(shù)大量缺失，骨小梁間隙極大，顯微結(jié)構(gòu)較模型組病理形態(tài)更為明顯。miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組介于miR-125a-3p inhibitor組與si-Notch1組之間，骨小梁厚度有所增加，但相比假手術(shù)組仍顯稀薄。見(jiàn)圖2。

2.5 抑制miR

-

125a

-

3p或干擾Notch1表達(dá)后免疫組化檢測(cè)各組骨組織BMP

-

2的表達(dá)

轉(zhuǎn)染8周后取骨折斷端組織，免疫組化檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2表達(dá)。結(jié)果顯示，BMP-2主要沉淀在骨小梁周?chē)俺晒羌?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯高于模型組，模型組與inhibitor NC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。同inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，si-Notch1組顯著減少（

P

＜0.05）。同miR-125a-3p inhibitor組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著降低，與si-Notch1組相比則明顯增多（均

P

＜0.05），

F

=68.573，

P

=0.002。見(jiàn)圖3。

2.6 抑制miR

-

125a

-

3p或干擾Notch1表達(dá)后骨密度及生物力分析

表5顯示轉(zhuǎn)染結(jié)束2、4、6、8周后，分別進(jìn)行骨密度測(cè)量，結(jié)果顯示，除假手術(shù)組以外，其它組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)骨密度呈梯度增長(zhǎng)；第4、6、8周，同假手術(shù)組相比，模型組骨密度明顯下降（

P

＜0.05）；模型組與inhibitor NC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。同inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組骨密度顯著上升，si-Notch1組顯著降低（

P

＜0.05）。同miR-125a-3p inhibitor組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組各項(xiàng)骨生物力學(xué)指標(biāo)顯著下降（

P

＜0.05）。表6 測(cè)術(shù)側(cè)股骨三點(diǎn)彎曲載荷顯示，同假手術(shù)組相比，模型組各項(xiàng)骨生物力學(xué)指標(biāo)，包括最大負(fù)載、極限應(yīng)力及剪切應(yīng)力均明顯下降（

P

＜0.05）；模型組與inhibitor NC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。同inhibitor NC組相比，miR-125a-3p inhibitor組各項(xiàng)骨生物力學(xué)指標(biāo)顯著上升，si-Notch1組顯著降低（

P

＜0.05）。同miR-125a-3p inhibitor組相比，miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1組各項(xiàng)骨生物力學(xué)指標(biāo)顯著下降；與si-Notch1組相比，則顯著上升（均

P

＜0.05）。提示抑制miR-125a-3p的表達(dá)可以改善骨質(zhì)疏松骨折大鼠的生物力學(xué)狀態(tài)。

表5 不同時(shí)間骨痂骨密度/（mg/cm2，±s）

表6 轉(zhuǎn)染8周后SD大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)/±s

3 討論

近年來(lái)，骨質(zhì)疏松病人的骨折發(fā)病率持續(xù)升高，同時(shí)由于病人骨骼質(zhì)量相對(duì)較差，更是給外科手術(shù)治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。所幸，基于miRNA的靶向基因的療法在治療骨科疾病上顯示出了巨大的潛力，包括骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折。本研究就miR-125a-3p表達(dá)對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的恢復(fù)展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)抑制miR-125a-3p可以促進(jìn)Notch1表達(dá)，增強(qiáng)骨密度及骨生物力學(xué)強(qiáng)度，增強(qiáng)BMP-2陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨質(zhì)疏松性大鼠骨折愈合。

近年來(lái)，miRNA和骨骼發(fā)展的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。例如，miR-141經(jīng)研究可以抑制破骨細(xì)胞生成以及骨的再吸收，從而為骨質(zhì)疏松治療提供新的治療方案。也有文獻(xiàn)表明，miR-137的異常表達(dá)會(huì)增加骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病概率。本研究研究中，筆者通過(guò)大鼠模型發(fā)現(xiàn)，miR-125a-3p在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠中表達(dá)較高，而Notch-1表達(dá)較低。經(jīng)生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-125a-3p可與Notch1的3" UTR區(qū)靶向結(jié)合，進(jìn)而抑制Notch1表達(dá)和通路激活。隨后，聯(lián)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-125a-3p表達(dá)后，骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨小梁厚度明顯增加，骨細(xì)胞數(shù)增多，骨質(zhì)得到改善，而抑制Notch1表達(dá)后，大鼠骨細(xì)胞數(shù)缺失嚴(yán)重。骨小梁缺失是骨質(zhì)疏松性骨折中最常見(jiàn)的主要癥狀。骨小梁評(píng)分近年來(lái)也發(fā)展成為一種判斷骨折風(fēng)險(xiǎn)的重要參考依據(jù)，骨小梁水平越高，患骨質(zhì)疏松性骨折的概率便越低。同時(shí)，前人研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b對(duì)成骨細(xì)胞的分化具有抑制作用。相似地，miR-125a-3p經(jīng)報(bào)道可以抑制成骨細(xì)胞增殖與分化，而且可以促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。而成骨細(xì)胞在骨形成、發(fā)育、重塑和修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。與miR-125a-3p相反，Notch受體在骨骼發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，在骨細(xì)胞中，Notch激活可提高骨質(zhì)量。同時(shí)，Notch可以抑制骨的再吸收，增加骨骼體積和質(zhì)量，促進(jìn)骨骼發(fā)展成熟。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-125a-3p可促進(jìn)BMP-2在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠中的陽(yáng)性表達(dá)，而抑制Notch1則會(huì)導(dǎo)致相反趨勢(shì)。BMP-2，即骨形成蛋白2，因在誘導(dǎo)成骨再生中發(fā)揮重要作用得以廣泛應(yīng)用。BMP-2能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)早期的骨形成和骨骼再生。有研究表明，上調(diào)Notch-1表達(dá)可以促進(jìn)BMP-2表達(dá)。類(lèi)似的，在脂多糖刺激下，Notch1表達(dá)及BMP-2表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的促成骨反應(yīng)。此外，通過(guò)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-125a-3p可提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨密度以及骨生物力，相應(yīng)地，抑制Notch-1表達(dá)后，大鼠的骨密度和骨生物力相關(guān)指標(biāo)，包括最大負(fù)載、極限應(yīng)力及剪切應(yīng)力，均顯著降低。上述結(jié)果證實(shí)了抑制miR-125a-3p或促進(jìn)Notch-1表達(dá)可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨骼修復(fù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p可與Notch-1靶向結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致骨細(xì)胞缺失，骨小梁減少，同時(shí)阻礙骨再生進(jìn)程。此研究發(fā)現(xiàn)為miRNA在治療骨關(guān)節(jié)類(lèi)疾病的臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。以往研究中，關(guān)于miR-125a-3p在骨再生以及骨質(zhì)量方面的研究較少，希望未來(lái)能有更多研究能證實(shí)我們的研究發(fā)現(xiàn)，并為骨質(zhì)疏松性骨折治療開(kāi)發(fā)新的有效方案。