閉塞性細支氣管炎（Bronchiolitis obliterans， BO）是一種小氣道損傷所致慢性氣流受限綜合征，成人常見于肺移植后，兒童BO常繼發(fā)于下呼吸道病毒感染。統(tǒng)計資料顯示，BO病人3年病死率達60%以上，存活者仍伴反復性氣促、喘息等，易繼發(fā)嚴重感染，需反復住院治療，嚴重威脅病人生命。目前BO缺乏特異性診斷手段，且國內(nèi)相關研究起步較晚，多數(shù)醫(yī)師對其認識不夠，常被誤診為非典型兒童慢性阻塞性肺病，在肺已發(fā)生不可逆性纖維化表現(xiàn)時才引起重視，未能早期診斷、治療是致預后不良的關鍵。相關研究已證實，氣道上皮細胞損害是BO發(fā)病始動者，同時伴多因素刺激，大量炎癥細胞活化、炎癥細胞因子分泌造成細支氣管上皮細胞壞死、脫落、成纖維細胞增殖及纖維化形成病理性改變?；|(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase，MMP-9）是明膠酶家族成員，正常情況組織表達量極少，特定條件下MMP-9表達失衡可誘發(fā)多種疾病及組織纖維化病理改變；抗菌肽37、中性粒細胞與多種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生關系密切。本研究首次探討兒童BO支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎癥程度的關系，旨在為臨床診斷提供循證依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南省兒童醫(yī)院2018年1月至2019年6月BO病兒42例作為觀察組，另選擇該院同期支氣管異物無并發(fā)感染病兒38例作為對照組。符合BO診斷標準；兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)基礎資料參見后述表2，經(jīng)統(tǒng)計均衡可比（

P

＞0.05）。病兒監(jiān)護人或其近親屬對病兒所受治療知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。納入標準：①胸部CT示馬賽克灌注征，急性下呼吸道感染或急性肺損傷后6周以上持續(xù)或反復性喘息、咳嗽或氣促、呼吸困難、喘鳴，支氣管擴張劑治療無效。②胸X線片與臨床表現(xiàn)輕重不符。排除標準：①原發(fā)性纖毛運動障礙、支氣管哮喘等肺部疾病。②先天性心臟病、免疫缺陷疾病。

1.2 方法

纖支鏡檢查：手術室靜脈麻醉輔助實施纖支鏡檢查，支氣管鏡（日本東芝公司）經(jīng)喉罩進入，觀察病兒氣道、左右側各葉、段支氣管情況及黏膜、分泌物性狀，取分泌物實施病原學診斷；采取生理鹽水1 mL/kg沖洗支氣管，連續(xù)3次，回收液體置無菌容器，0～4℃保存待測。

灌洗液處理：首先離心10 min（4℃，3 500 r/min），分別取上清液、沉淀，分裝已備好凍存管內(nèi)，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

酶聯(lián)免疫吸附測定：以酶聯(lián)免疫吸附測定檢測灌洗液MMP-9、抗菌肽37、白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-13（IL-13）及半胱氨酰白三烯（LTS）水平，酶聯(lián)儀于450 nm波長下檢測吸光度，參考標準物濃度計算樣品濃度。

灌洗液中性粒細胞檢測：取已制備沉淀0.5 mL于無菌試管內(nèi)，加二流蘇糖醇2.5 mL溶解，加2.5 mL冰醋酸（15%）搖勻，滴管吸取液體滴至血細胞計數(shù)板涂片，計數(shù)細胞分類及總數(shù)，涂片標準計數(shù)200個細胞，低倍鏡中性粒細胞＞45個。

1.3 觀察指標

（1）對比兩組支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞含量。（2）分析支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞與兒童BO的關系。（3）對比不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞含量。（4）對比不同病情程度病兒氣道炎癥因子（IL-17、IL-13、LTS）水平。（5）Pearson相關性分析檢驗MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎性因子（IL-17、IL-13、LTS）相關性。病情程度判定標準見表1。

表1 閉塞性細支氣管炎病情程度判定標準

2 結果

2.1 兩組基線資料及支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞含量的比較

兩組基線資料（性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)）比較，均差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。觀察組支氣管肺泡灌洗液MMP-9、中性粒細胞含量高于對照組，抗菌肽37含量低于對照組（

P

＜0.05），見表2。

2.2 支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞與兒童BO的關系

建立非條件logistic回歸模型，以本研究資料為樣本，以BO情況為因變量，賦值1=BO，0=非BO。以前述單因素分析（表2）中P＜0.10的指標/因素為自變量，共3個。該3指標均為連續(xù)數(shù)值資料，為提高統(tǒng)計效率并使回歸結果清晰，按兩組總均值進行分段（分層），轉化成兩分類變量。各變量賦值見表3。回歸結果：3個自變量均被保留入回歸方程（

P

＜0.05）。提示：支氣管肺泡灌洗液的MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞水平是兒童BO情況的影響因素或關聯(lián)影響因素。詳見表3。此外，本次回歸的廣義決定系數(shù)Cox-Snell

R

=0.513，不算太高，提示其變異被回歸模型解釋的比例不是太大，模型預測的準確性稍差。

表2 兩組基線資料及支氣管肺泡灌洗液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細胞含量的比較

表3 支氣管肺泡灌洗液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細胞與兒童患閉塞性細支氣管炎的logistic回歸結果

2.3 不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞含量

進一步探討不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞含量的差別，采用單因素方差分析，結果各指標整體差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。多重比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：重度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、中性粒細胞含量高于中度、輕度病兒，抗菌肽37低于中度、輕度病兒（

P

＜0.05），詳見表4。

表4 不同病情程度閉塞性細支氣管炎病兒支氣管肺泡灌洗液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細胞含量比較/±s

2.4 不同病情程度病兒氣道炎癥因子水平

仿前行單因素方差分析，不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS含量相比，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）；多重比較并結合主要數(shù)據(jù)分析：重度病兒支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS含量高于中度、輕度病兒（

P

＜0.05），見表5。

2.5 MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細胞與氣道炎性因

子相關性

Pearson相關性分析，MMP-9（

r

=0.696；

r

=0.615；

r

=0.612）、中性粒細胞（

r

=0.674；

r

=0.474；

r

=0.826）與IL-17、IL-13、LTS呈正相關，抗菌肽37（

r

=-0.762；

r

=-0.617；

r

=-0.685）與IL-17、IL-13、LTS呈負相關（

P

＜0.05）。

表5 不同病情程度閉塞性細支氣管炎病兒氣道炎癥因子水平比較（-x±s）

3 討論

目前肺活檢是BO診斷的“金標準”，但小兒受肺組織嬌嫩、各項生理機能發(fā)育不完善等因素影響，肺活檢困難。臨床報道，眾多生理、病理過程參與BO發(fā)病，如肺組織修復、重建、血管形成、炎癥反應等。因此，細胞相關因子診斷BO是當前研究熱點。

MMP-9是明膠酶家族主要成員，負責水解變性膠原，主要由內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、肺泡上皮細胞生成，在所有MMPs成員中，僅MMP-9可特異性降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原、巢蛋白?；A研究顯示，MMP-9與其抑制因子表達失衡是哮喘、肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)纖維化疾病主要危險因素。BO進展過程中肺纖維化是其主要病理變化，本研究檢測發(fā)現(xiàn)，BO病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9水平高于支氣管異物病兒（

P

＜0.05），與劉會青等研究結果近似。此外，本研究還對不同病情程度BO病兒進行研究發(fā)現(xiàn)，隨病情程度加重，支氣管肺泡灌洗液MMP-9水平呈升高趨勢，與氣道炎性因子IL-17、IL-13、LTS呈正相關（

P

＜0.05），推測MMP-9參與BO發(fā)病過程，并通過介導炎癥損害，加重BO病情。MMP-9酶解活性可破壞細胞基底膜完整性，刺激成纖維細胞入侵肺組織，激活肺組織炎癥細胞，進一步損害肺組織。但有研究顯示，肺移植后BO病人并未發(fā)現(xiàn)灌洗液MMP-9持續(xù)升高現(xiàn)象。本研究結果與此不符，究其原因可能是：（1）不同病因致病機制不盡相同，移植后BO主要為慢性排異反應致肺纖維化，而兒童BO主要與反復感染有關；（2）兩者可能處于不同疾病發(fā)展階段，雖氣道重塑是組織破壞與重構同時進行的階段，但肺部纖維化初級階段主要以基質(zhì)、間質(zhì)破壞為主，本研究所選病例為首次確診病兒，可能處于相對早期階段，MMP-9相關炎癥反應活躍。抗菌肽37是具有極強抗菌活性的內(nèi)源性物質(zhì)，具有廣譜抗菌、強堿性、熱穩(wěn)定性等特征，尤其對革蘭氏陰性/陽性菌、真菌等菌種殺傷效果明顯，但機體出現(xiàn)免疫相關疾病時可致抗菌肽37表達異常。有學者研究顯示，在過敏性皮炎、哮喘、肺部炎癥病人中，外周血抗菌肽37明顯降低，原因在于呼吸道炎癥誘導痰液內(nèi)中性粒細胞水平升高，并強化炎癥細胞活性，介導炎癥瀑布效應，參與疾病進展，抗菌肽37抗菌效果削弱。本研究結果顯示，觀察組支氣管肺泡灌洗液抗菌肽37含量低于對照組，中性粒細胞含量高于對照組（

P

＜0.05），與上述研究變化趨勢一致。IL-17、IL-13、LTS是重要炎癥標志物，多篇文獻證實，在BO病人痰液、支氣管肺泡灌洗液中明顯升高，且與肺功能相關，可在一定程度上反映BO病情程度。本研究還發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS水平與中性粒細胞呈正相關，與抗菌肽37呈負相關（

P

＜0.05），說明抗菌肽37、中性粒細胞與BO病兒氣道炎癥程度關系密切。分析作用機制可能是：BO病兒受病毒侵襲，機體固有免疫紊亂表現(xiàn)自然殺傷細胞數(shù)降低，抗菌肽37消耗加劇，同時中性粒細胞等炎癥細胞功能異常激活，持續(xù)分泌IL-17、IL-13、LTS炎性因子，且樹突狀細胞成熟障礙進一步加重肺損害。

綜上可知，BO病兒存在呼吸道MMP-9、抗菌肽37、中性粒細胞表達異常，其表達異常程度升高可能會加重氣道炎癥程度，可為臨床診斷、制定治療方案提供新方向。