閉塞性細(xì)支氣管炎（Bronchiolitis obliterans， BO）是一種小氣道損傷所致慢性氣流受限綜合征，成人常見(jiàn)于肺移植后，兒童BO常繼發(fā)于下呼吸道病毒感染。統(tǒng)計(jì)資料顯示，BO病人3年病死率達(dá)60%以上，存活者仍伴反復(fù)性氣促、喘息等，易繼發(fā)嚴(yán)重感染，需反復(fù)住院治療，嚴(yán)重威脅病人生命。目前BO缺乏特異性診斷手段，且國(guó)內(nèi)相關(guān)研究起步較晚，多數(shù)醫(yī)師對(duì)其認(rèn)識(shí)不夠，常被誤診為非典型兒童慢性阻塞性肺病，在肺已發(fā)生不可逆性纖維化表現(xiàn)時(shí)才引起重視，未能早期診斷、治療是致預(yù)后不良的關(guān)鍵。相關(guān)研究已證實(shí)，氣道上皮細(xì)胞損害是BO發(fā)病始動(dòng)者，同時(shí)伴多因素刺激，大量炎癥細(xì)胞活化、炎癥細(xì)胞因子分泌造成細(xì)支氣管上皮細(xì)胞壞死、脫落、成纖維細(xì)胞增殖及纖維化形成病理性改變?；|(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase，MMP-9）是明膠酶家族成員，正常情況組織表達(dá)量極少，特定條件下MMP-9表達(dá)失衡可誘發(fā)多種疾病及組織纖維化病理改變；抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與多種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生關(guān)系密切。本研究首次探討兒童BO支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與氣道炎癥程度的關(guān)系，旨在為臨床診斷提供循證依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南省兒童醫(yī)院2018年1月至2019年6月BO病兒42例作為觀察組，另選擇該院同期支氣管異物無(wú)并發(fā)感染病兒38例作為對(duì)照組。符合BO診斷標(biāo)準(zhǔn)；兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)基礎(chǔ)資料參見(jiàn)后述表2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)均衡可比（

P

＞0.05）。病兒監(jiān)護(hù)人或其近親屬對(duì)病兒所受治療知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸部CT示馬賽克灌注征，急性下呼吸道感染或急性肺損傷后6周以上持續(xù)或反復(fù)性喘息、咳嗽或氣促、呼吸困難、喘鳴，支氣管擴(kuò)張劑治療無(wú)效。②胸X線片與臨床表現(xiàn)輕重不符。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、支氣管哮喘等肺部疾病。②先天性心臟病、免疫缺陷疾病。

1.2 方法

纖支鏡檢查：手術(shù)室靜脈麻醉輔助實(shí)施纖支鏡檢查，支氣管鏡（日本東芝公司）經(jīng)喉罩進(jìn)入，觀察病兒氣道、左右側(cè)各葉、段支氣管情況及黏膜、分泌物性狀，取分泌物實(shí)施病原學(xué)診斷；采取生理鹽水1 mL/kg沖洗支氣管，連續(xù)3次，回收液體置無(wú)菌容器，0～4℃保存待測(cè)。

灌洗液處理：首先離心10 min（4℃，3 500 r/min），分別取上清液、沉淀，分裝已備好凍存管內(nèi)，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定：以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)灌洗液MMP-9、抗菌肽37、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）及半胱氨酰白三烯（LTS）水平，酶聯(lián)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，參考標(biāo)準(zhǔn)物濃度計(jì)算樣品濃度。

灌洗液中性粒細(xì)胞檢測(cè)：取已制備沉淀0.5 mL于無(wú)菌試管內(nèi)，加二流蘇糖醇2.5 mL溶解，加2.5 mL冰醋酸（15%）搖勻，滴管吸取液體滴至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板涂片，計(jì)數(shù)細(xì)胞分類及總數(shù)，涂片標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，低倍鏡中性粒細(xì)胞＞45個(gè)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）對(duì)比兩組支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量。（2）分析支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與兒童BO的關(guān)系。（3）對(duì)比不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量。（4）對(duì)比不同病情程度病兒氣道炎癥因子（IL-17、IL-13、LTS）水平。（5）Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與氣道炎性因子（IL-17、IL-13、LTS）相關(guān)性。病情程度判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 閉塞性細(xì)支氣管炎病情程度判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料及支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量的比較

兩組基線資料（性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)）比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。觀察組支氣管肺泡灌洗液MMP-9、中性粒細(xì)胞含量高于對(duì)照組，抗菌肽37含量低于對(duì)照組（

P

＜0.05），見(jiàn)表2。

2.2 支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與兒童BO的關(guān)系

建立非條件logistic回歸模型，以本研究資料為樣本，以BO情況為因變量，賦值1=BO，0=非BO。以前述單因素分析（表2）中P＜0.10的指標(biāo)/因素為自變量，共3個(gè)。該3指標(biāo)均為連續(xù)數(shù)值資料，為提高統(tǒng)計(jì)效率并使回歸結(jié)果清晰，按兩組總均值進(jìn)行分段（分層），轉(zhuǎn)化成兩分類變量。各變量賦值見(jiàn)表3?；貧w結(jié)果：3個(gè)自變量均被保留入回歸方程（

P

＜0.05）。提示：支氣管肺泡灌洗液的MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞水平是兒童BO情況的影響因素或關(guān)聯(lián)影響因素。詳見(jiàn)表3。此外，本次回歸的廣義決定系數(shù)Cox-Snell

R

=0.513，不算太高，提示其變異被回歸模型解釋的比例不是太大，模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性稍差。

表2 兩組基線資料及支氣管肺泡灌洗液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量的比較

表3 支氣管肺泡灌洗液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與兒童患閉塞性細(xì)支氣管炎的logistic回歸結(jié)果

2.3 不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量

進(jìn)一步探討不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量的差別，采用單因素方差分析，結(jié)果各指標(biāo)整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：重度病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9、中性粒細(xì)胞含量高于中度、輕度病兒，抗菌肽37低于中度、輕度病兒（

P

＜0.05），詳見(jiàn)表4。

表4 不同病情程度閉塞性細(xì)支氣管炎病兒支氣管肺泡灌洗液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞含量比較/±s

2.4 不同病情程度病兒氣道炎癥因子水平

仿前行單因素方差分析，不同病情程度病兒支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：重度病兒支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS含量高于中度、輕度病兒（

P

＜0.05），見(jiàn)表5。

2.5 MMP

-

9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與氣道炎性因

子相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析，MMP-9（

r

=0.696；

r

=0.615；

r

=0.612）、中性粒細(xì)胞（

r

=0.674；

r

=0.474；

r

=0.826）與IL-17、IL-13、LTS呈正相關(guān)，抗菌肽37（

r

=-0.762；

r

=-0.617；

r

=-0.685）與IL-17、IL-13、LTS呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.05）。

表5 不同病情程度閉塞性細(xì)支氣管炎病兒氣道炎癥因子水平比較（-x±s）

3 討論

目前肺活檢是BO診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但小兒受肺組織嬌嫩、各項(xiàng)生理機(jī)能發(fā)育不完善等因素影響，肺活檢困難。臨床報(bào)道，眾多生理、病理過(guò)程參與BO發(fā)病，如肺組織修復(fù)、重建、血管形成、炎癥反應(yīng)等。因此，細(xì)胞相關(guān)因子診斷BO是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

MMP-9是明膠酶家族主要成員，負(fù)責(zé)水解變性膠原，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞生成，在所有MMPs成員中，僅MMP-9可特異性降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原、巢蛋白?；A(chǔ)研究顯示，MMP-9與其抑制因子表達(dá)失衡是哮喘、肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)纖維化疾病主要危險(xiǎn)因素。BO進(jìn)展過(guò)程中肺纖維化是其主要病理變化，本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BO病兒支氣管肺泡灌洗液MMP-9水平高于支氣管異物病兒（

P

＜0.05），與劉會(huì)青等研究結(jié)果近似。此外，本研究還對(duì)不同病情程度BO病兒進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨病情程度加重，支氣管肺泡灌洗液MMP-9水平呈升高趨勢(shì)，與氣道炎性因子IL-17、IL-13、LTS呈正相關(guān)（

P

＜0.05），推測(cè)MMP-9參與BO發(fā)病過(guò)程，并通過(guò)介導(dǎo)炎癥損害，加重BO病情。MMP-9酶解活性可破壞細(xì)胞基底膜完整性，刺激成纖維細(xì)胞入侵肺組織，激活肺組織炎癥細(xì)胞，進(jìn)一步損害肺組織。但有研究顯示，肺移植后BO病人并未發(fā)現(xiàn)灌洗液MMP-9持續(xù)升高現(xiàn)象。本研究結(jié)果與此不符，究其原因可能是：（1）不同病因致病機(jī)制不盡相同，移植后BO主要為慢性排異反應(yīng)致肺纖維化，而兒童BO主要與反復(fù)感染有關(guān)；（2）兩者可能處于不同疾病發(fā)展階段，雖氣道重塑是組織破壞與重構(gòu)同時(shí)進(jìn)行的階段，但肺部纖維化初級(jí)階段主要以基質(zhì)、間質(zhì)破壞為主，本研究所選病例為首次確診病兒，可能處于相對(duì)早期階段，MMP-9相關(guān)炎癥反應(yīng)活躍?？咕?7是具有極強(qiáng)抗菌活性的內(nèi)源性物質(zhì)，具有廣譜抗菌、強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性等特征，尤其對(duì)革蘭氏陰性/陽(yáng)性菌、真菌等菌種殺傷效果明顯，但機(jī)體出現(xiàn)免疫相關(guān)疾病時(shí)可致抗菌肽37表達(dá)異常。有學(xué)者研究顯示，在過(guò)敏性皮炎、哮喘、肺部炎癥病人中，外周血抗菌肽37明顯降低，原因在于呼吸道炎癥誘導(dǎo)痰液內(nèi)中性粒細(xì)胞水平升高，并強(qiáng)化炎癥細(xì)胞活性，介導(dǎo)炎癥瀑布效應(yīng)，參與疾病進(jìn)展，抗菌肽37抗菌效果削弱。本研究結(jié)果顯示，觀察組支氣管肺泡灌洗液抗菌肽37含量低于對(duì)照組，中性粒細(xì)胞含量高于對(duì)照組（

P

＜0.05），與上述研究變化趨勢(shì)一致。IL-17、IL-13、LTS是重要炎癥標(biāo)志物，多篇文獻(xiàn)證實(shí)，在BO病人痰液、支氣管肺泡灌洗液中明顯升高，且與肺功能相關(guān)，可在一定程度上反映BO病情程度。本研究還發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-13、LTS水平與中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)，與抗菌肽37呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.05），說(shuō)明抗菌肽37、中性粒細(xì)胞與BO病兒氣道炎癥程度關(guān)系密切。分析作用機(jī)制可能是：BO病兒受病毒侵襲，機(jī)體固有免疫紊亂表現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞數(shù)降低，抗菌肽37消耗加劇，同時(shí)中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞功能異常激活，持續(xù)分泌IL-17、IL-13、LTS炎性因子，且樹突狀細(xì)胞成熟障礙進(jìn)一步加重肺損害。

綜上可知，BO病兒存在呼吸道MMP-9、抗菌肽37、中性粒細(xì)胞表達(dá)異常，其表達(dá)異常程度升高可能會(huì)加重氣道炎癥程度，可為臨床診斷、制定治療方案提供新方向。