乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，約有24%～60%的乳腺癌病人因?yàn)槟[瘤轉(zhuǎn)移而死亡。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）也被稱為擴(kuò)散因子，是具有促有絲分裂的一種獨(dú)特的生長(zhǎng)因子。HCF由間充質(zhì)細(xì)胞所分泌，其受體酪氨酸蛋白激酶MET（c-met）蛋白作為一種闊膜蛋白，存在于多種上皮細(xì)胞膜上。當(dāng)HCF與c-met蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致c-met蛋白酪氨酸激酶活性的激活，從而使該通路上多種底物蛋白發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。本研究探討分析HGF/c-met信號(hào)通路與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為了闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月至2019年3月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌標(biāo)本75例、乳腺纖維腺瘤標(biāo)本60例以及癌旁正常乳腺組織標(biāo)本50例。乳腺癌病理類型均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，正常乳腺組織取自乳腺癌根治術(shù)后標(biāo)本距離腫瘤（或腫瘤結(jié)節(jié)）邊緣大于5 cm的區(qū)域。75例乳腺癌病人均為女性，年齡（51.93±7.32）歲，范圍為33～76歲，其中左乳腺39例、右乳腺36例，腫瘤直徑≥2 cm病人33例、＜2 cm病人42例；TNM分期Ⅰ期21例、Ⅱ期25例、Ⅲ期19例、Ⅳ期10例；其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人35例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人40例。

1.2 方法

1.2.1

SP免疫組化法 石蠟包埋連續(xù)切片4μm，3%過氧化氫孵育10 min封閉滅活內(nèi)源性過氧化物酶；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 min后將切片放入0.01 mL/L枸櫞酸緩沖液中微波抗原修復(fù)10 min；加入山羊血清封閉60 min（37℃），滴加適當(dāng)濃度的一抗，37℃孵育60 min后4℃過夜，PBS洗5 min×3；滴加羊抗兔/鼠IgG二抗，室溫孵育15 min，PBS洗5 min×3；3，3"-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染核，封片、觀察。使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

HGF、c-met判斷標(biāo)準(zhǔn)：HGF、c-met以正常黏膜上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)：①選取染色均勻的組織區(qū)域，在400倍視野下計(jì)數(shù)著色細(xì)胞占視野總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，共隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其平均值，按照百分?jǐn)?shù)記分，0分：0%；1分：＞0%～25%；2分：＞25%～50%；3分：＞50%。②按照細(xì)胞著色強(qiáng)弱程度評(píng)分：0分：不著色；1分：著色弱；2分：中等著色；3分：著色強(qiáng)。按照①、②值之和判斷結(jié)果，0分：陰性（-）；1～2分：弱陽(yáng)性（+）；3～4分：中等陽(yáng)性（++）；5～6分：強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

β連環(huán)素（β-catenin）判斷標(biāo)準(zhǔn)：β-catenin在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核3個(gè)部位表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行判斷，正常β-catenin表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，當(dāng)＞70%細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)為正常表達(dá)，反之為細(xì)胞膜表達(dá)缺失；當(dāng)＞10%細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)為異位表達(dá)。將細(xì)胞膜表達(dá)缺失以及異位表達(dá)均作為異常表達(dá)。

1.2.2

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)方法取100 mg組織（液氮中保存）放入勻漿器中，在冰浴條件下將組織剪碎后立即加入預(yù)冷的Trizol提取液1 mL，充分勻漿，根據(jù)試劑使用說(shuō)明提取組織RNA，使用紫外分光光度計(jì)定量RNA含量。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃45 s、55℃30 s、72℃30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃8 min。將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，用目的基因吸光度與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）吸光度比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三種組織中各蛋白免疫組化表達(dá)情況

HGF、c-met、β-catenin在乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤組織以及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見表1。

表1 不同乳腺組織樣本中各蛋白免疫組化表達(dá)情況比較

2.2 三種組織中HGF、c

-

met、

β-

catenin mRNA相對(duì)表達(dá)情況

在乳腺癌、乳腺纖維腺瘤及癌旁正常乳腺組織中HGF、c-met mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），其中乳腺癌最高、乳腺纖維腺瘤次之；而乳腺癌、乳腺纖維腺瘤以及癌旁正常乳腺組織中β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2、圖1。

表2 三種乳腺組織中HGF、c-met、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)情況/±s

2.3 HGF表達(dá)與乳腺癌病人病理相關(guān)性分析

HGF表達(dá)陽(yáng)性率與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、ER表達(dá)、HER-2表達(dá)有關(guān)（

P

＜0.05）；c-met蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（

P

＜0.05）；β-catenin蛋白表達(dá)異常率與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小密切相關(guān)（

P

＜0.05）。見表3。

3 討論

圖1 PCR顯示HGF、c-met及β-catenin在75例乳腺癌組織中的表達(dá)

目前乳腺癌治療靶點(diǎn)的研究仍處于起步階段。HGF可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，同時(shí)還可促進(jìn)腫瘤組織周圍血管以及淋巴管的形成，從而為腫瘤轉(zhuǎn)移提供通道，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移可能具有促進(jìn)作用，并可能與乳腺癌惡變程度有關(guān)。HGF由間充質(zhì)細(xì)胞所分泌，其受體c-met蛋白作為一種跨膜蛋白，在多種上皮細(xì)胞膜上均有表達(dá)。當(dāng)HGF與c-met蛋白發(fā)生特異性結(jié)合之后，可激活cmet受體蛋白的酪氨酸激酶活性，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。β-catenin是一種重要的胞內(nèi)蛋白，是具有癌基因潛能的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，同時(shí)也是配體蛋白（Wnt）/連環(huán)蛋白（Catenin）信號(hào)通路中的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是細(xì)胞間重要的黏附分子之一，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及遷移過程中具有著重要作用。研究顯示，HGF/c-met介導(dǎo)的信號(hào)通路可促使Wnt/Catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)分子β-catenin酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，使β-catenin不能與上皮鈣黏素胞內(nèi)部分結(jié)合形成復(fù)合體，從而降低細(xì)胞間黏附作用，而影響腫瘤組織的侵襲和遷移。

表3 HGF、c-met、β-catenin表達(dá)與乳腺癌病人75例臨床病理相關(guān)性分析/例（%）

本研究結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，HGF、c-met蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于乳腺纖維腺瘤以及癌旁正常乳腺組織，而β-catenin蛋白表達(dá)異常率（包括細(xì)胞膜表達(dá)缺失以及異位表達(dá)）顯著高于乳腺纖維腺瘤以及癌旁正常乳腺組織。與學(xué)者相關(guān)研究結(jié)果相似，提示在乳腺癌中，HGF/c-met信號(hào)通路處于高表達(dá)狀態(tài)，且β-catenin異常表達(dá)明顯升高。此外，RT-PCR結(jié)果顯示，HGF、c-met mRNA相對(duì)表達(dá)量在乳腺癌組織中最高，乳腺纖維腺瘤次之，進(jìn)一步證實(shí)了HGF、c-met在乳腺癌組織中的高表達(dá)；而β-catenin mRNA在三種不同組織中的相對(duì)表達(dá)含量無(wú)明顯差異，可能考慮β-catenin在正常組織中均有表達(dá)，而在乳腺癌組織中出現(xiàn)表現(xiàn)為表達(dá)異常，通過RT-PCR法僅代表mRNA表達(dá)相對(duì)含量，而無(wú)法定位具體表達(dá)部位。

此外，本研究結(jié)果顯示，HGF表達(dá)陽(yáng)性率與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、ER表達(dá)、HER-2表達(dá)有關(guān)（

P

＜0.05）；c-met蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（

P

＜0.05）；βcatenin蛋白表達(dá)異常率與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小密切相關(guān)（

P

＜0.05）。HGF、c-met、βcatenin蛋白與乳腺癌疾病進(jìn)展、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移具有著密切的聯(lián)系，其中HGF蛋白表達(dá)與ER表達(dá)、HER-2表達(dá)有關(guān)，提示HGF/c-met信號(hào)通路、βcatenin蛋白可能為乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制之一，還需進(jìn)一步深入研究分析。

綜上所述，乳腺癌組織中HGF、c-met蛋白高表達(dá)而β-catenin蛋白異常表達(dá)，且HGF/c-met信號(hào)通路及β-catenin蛋白與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。