肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，它是全球 導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因。全球每年新增肝癌病例782 500例，死亡745 500例，僅中國(guó)就占總病例和死亡人數(shù)的50%左右。其中肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的85%～90%。目前，手術(shù)切除和肝移植是唯一可能治愈的策略，但在根治性切除后，尤其是在殘余肝中，復(fù)發(fā)率仍然很高，約80%病人在診斷時(shí)已為腫瘤晚期，中位生存期約為8個(gè)月，其預(yù)后普遍令人沮喪。近年來，人們對(duì)其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但有關(guān)肝細(xì)胞癌惡性和轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制尚不明確，因此，識(shí)別肝細(xì)胞癌可靠的腫瘤分子生物標(biāo)記物對(duì)于個(gè)性化治療和評(píng)估預(yù)后至關(guān)重要。神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP-1）最初被描述為對(duì)神經(jīng)元發(fā)育具有重要作用的信號(hào)受體，同時(shí)很多研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1在許多癌癥的血管生成和惡性進(jìn)展中起重要作用，如：乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、黑素瘤和胰腺癌等。但它在肝細(xì)胞癌方面的相關(guān)研究鮮見報(bào)道，因此，本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織及癌周正常肝組織的NRP-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）表達(dá)情況，探討NRP-l、VEGFR2在肝細(xì)胞癌的表達(dá)與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，為肝細(xì)胞癌的診治、預(yù)后評(píng)估提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年11月至2018年11月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)確診為肝細(xì)胞癌的石蠟包埋標(biāo)本共40例，并獲得20例癌旁正常肝組織標(biāo)本，均有完整的臨床資料。所有病人術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療，且經(jīng)影像學(xué)檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。男性25例，女性15例；中位年齡60歲；有慢性肝炎病毒感染26例，無慢性肝炎病毒感染14例；合并肝硬化26例，未合并肝硬化14例；Child-Pugh分級(jí)A級(jí)29例、B級(jí)11例。病理分級(jí)高分化8例，中分化21例，低分化11例；TNM分期Ⅰ期22例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例。對(duì)所有病人進(jìn)行至少為期1年的隨訪，記錄病人術(shù)后1年復(fù)發(fā)情況，末次隨訪時(shí)間為2019年11月。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

主要試劑包括購自美國(guó)的affinity公司的兔抗人NRP-1單克隆抗體，購自美國(guó)的proteintech公司的兔抗人VEGFR2單克隆抗體，購自福州邁新生物科技有限公司的兔SP免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑。將40例肝細(xì)胞癌組織及20例正常肝組織標(biāo)本蠟塊制備成4μm厚連續(xù)切片，60℃烤片2 h，行NRP-1和VEGFR2免疫組化染色。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中NRP-1和VEGFR2蛋白的表達(dá)情況，選取3個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存（所有圖片均400×拍攝），使用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行處理，計(jì)算平均光密度（average optical density，AOD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Shapiro-Wilk（W檢驗(yàn)）判斷數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。NRP-1和VEGFR2在肝細(xì)胞癌和癌旁正常肝組織的表達(dá)及與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用兩獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)。NRP-1和VEGFR2的表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。NRP-1和VEGFR2的表達(dá)高低與病人術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系采用

χ

檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)

α

＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織及正常肝組織的NRP

-

1、VEGFR2的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，NRP-1和VEGFR2主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上（圖1）。NRP-1、VEGFR2在肝細(xì)胞癌組織中AOD分別為（0.398±0.051）、（0.454±0.058），在正常肝組織中的AOD分別為（0.244±0.095）、（0.337±0.064），經(jīng)

t

檢驗(yàn)分析NRP-1、VEGFR2在肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=6.815，

P

＜0.001；

t

=7.155，

P

＜0.001）。

2.2 NRP

-

1、VEGFR2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

肝細(xì)胞癌組織的NRP-1、VEGFR2的表達(dá)水平與病人性別、年齡、有無慢性肝炎病毒感染、甲胎蛋白水平、腫瘤數(shù)目、有無肝硬化、Child-Pugh分級(jí)無明顯相關(guān)性（均

P

＞0.0

5

）；而與病人腫瘤的最大徑、有無血管侵犯、分化程度、TNM分期有關(guān)（均

P

＜0.05）。見表1。

2.3 肝細(xì)胞癌組織中NRP

-

1與VEGFR2的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，NRP-1和VEGFR2在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)存在正相關(guān)（

r

=0.789，

P

＜0.001）。

2.4 肝細(xì)胞癌組織中NRP

-

1、VEGFR2的表達(dá)與病人術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系分析

根據(jù)NRP-1、VEGFR2各自的算術(shù)平均數(shù)分為高、低表達(dá)組，肝細(xì)胞癌組織中NRP-1、VEGFR2低表達(dá)組術(shù)后1年復(fù)發(fā)率［5.56%（1/18）、20.00%（4/20）］明顯低于NRP-1、VEGFR2高表達(dá)組［63.64%（14/22）、55.00%（11/20）］（

χ

=14.249，

P

＜0.001；

χ

=5.227，

P

=0.022）。

3 討論

肝細(xì)胞癌是一種富血供腫瘤，它的發(fā)生、進(jìn)展與新生腫瘤血管的生成有密切關(guān)系。血管生成是腫瘤進(jìn)展的重要組成部分。新血管的生成為細(xì)胞增殖提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)去除二氧化碳和代謝廢物。不僅支持了惡性腫瘤的快速生長(zhǎng)，而且通過提供一條逃逸到身體中遠(yuǎn)部位的路徑，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）是其中一個(gè)關(guān)鍵的促血管生成信號(hào)分子，它主要通過與VEGFR2的相互作用來促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、骨架重組、分化和新脈管系統(tǒng)的形成及動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）從骨髓進(jìn)入外周循環(huán)。VEGF的過度表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。本研究檢測(cè)了肝細(xì)胞癌組織中VEGFR2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與正常肝組織細(xì)胞相比，肝細(xì)胞癌組織中VEGFR2的表達(dá)明顯升高，這與在其他惡性腫瘤的表達(dá)相符。同時(shí)我們進(jìn)一步分析了VEGFR2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌病人的臨床病理特征及復(fù)發(fā)情況的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它與腫瘤組織的最大徑、有無血管侵犯、分化程度、TNM分期明顯相關(guān)，VEGFR2高表達(dá)的肝細(xì)胞癌病人組術(shù)后1年復(fù)發(fā)率明顯高于VEGFR2低表達(dá)的肝細(xì)胞癌病人組，這表明VEGFR2的表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲性有關(guān)，并可作為臨床判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

表1 NRP-1、VEGFR2的表達(dá)與40例肝細(xì)胞癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系/±s

NRP-1是I型跨膜糖蛋白，可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生的各個(gè)方面，如血管生成、細(xì)胞存活、遷移、侵襲和化療耐藥。NRP-1參與腫瘤進(jìn)展的機(jī)制，主要與腫瘤血管生成有關(guān)，這與其通過表達(dá)在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGFR2增強(qiáng)VEGF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)。NRP-1還被證明介導(dǎo)了依賴血小板衍生生長(zhǎng)因子B（platelet derived growth factor B，PDGF-B）的間充質(zhì)干細(xì)胞-周細(xì)胞的轉(zhuǎn)變和募集。這兩個(gè)事件在腫瘤血管重構(gòu)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起著重要作用。此外，NRP-1能結(jié)合幾種促血管生成細(xì)胞因子，并能放大肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導(dǎo)的促血管生成的刺激信號(hào)，而且已經(jīng)在膠質(zhì)瘤、胰腺癌和前列腺癌等中得到證實(shí)。本研究結(jié)果顯示NRP-1在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，在正常肝組織中低表達(dá)或不表達(dá)，這與其他研究相一致，這些結(jié)果提示NRP-1表達(dá)與正常組織的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。更重要的是，我們還發(fā)現(xiàn)它與腫瘤組織的最大徑、分化程度、TNM分期明顯相關(guān)。與NRP-1低表達(dá)的病人相比，NRP-1高表達(dá)的病人的顯示不良的預(yù)后，這表明NRP-1可以作為肝細(xì)胞癌病人的一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果與前期王金爽、楊麗報(bào)告的其在NSCLC的作用相類似。

我們還檢測(cè)了肝細(xì)胞癌中NRP-1與VEGFR2的相關(guān)性，兩者成正相關(guān)（

r

=0.789，

P

＜0.001），而VEGFR2對(duì)腫瘤血管生成、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和增加血管通透性至關(guān)重要，因此，NRP-1可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞癌中的VEGFR2表達(dá)來促進(jìn)血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)NRP-1是一種共受體來介導(dǎo)VEGFR2的活性，可增強(qiáng)VEGF與VEGFR2的結(jié)合，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF介導(dǎo)的下游信號(hào)通路。也有研究表明NRP-1不僅促進(jìn)VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、信號(hào)輸出，還可促進(jìn)VEGFR2非依賴性的VEGF-A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、整合素介導(dǎo)的纖維連接蛋白組裝和基質(zhì)黏附。本研究進(jìn)一步地支持了他們的觀點(diǎn)。

目前，阻斷血管生成已成為一種突出的策略，以補(bǔ)充化療方法來治療癌癥。雖然兩項(xiàng)大型國(guó)際多中心Ⅲ期臨床試驗(yàn)均充分證明了索拉非尼對(duì)晚期肝細(xì)胞癌有一定的生成獲益，但仍不能令人滿意。最近，一種人IgG單克隆抗體被開發(fā)出來，阻斷位于VEGF結(jié)合位點(diǎn)的NRP-1 B1B2結(jié)構(gòu)域，值得注意的是，該抗體阻斷了血管生成和血管重塑。因此，NRP-1可以作為潛在的血管生成靶點(diǎn)。

總之，本研究結(jié)果提示NRP-1、VEGFR2的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可以作為判斷肝細(xì)胞癌病人預(yù)后的分子標(biāo)志。同時(shí)針對(duì)NRP-1的靶向藥物正在研制中，NRP-1有望成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。由于本研究的樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，無法得出NPR-1、VEGFR2的表達(dá)與總生存期的關(guān)系，因此需要繼續(xù)隨訪病例，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。