胰腺癌是一種惡性程度高的惡性腫瘤，胰腺癌早期即可發(fā)生局部浸潤及轉(zhuǎn)移。目前手術(shù)、放療等手段對胰腺癌的治療效果較差且病人生存預(yù)后差。因而從胰腺癌的發(fā)生機(jī)制方面探究有效治療胰腺癌的方法具有十分重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）可參與基因轉(zhuǎn)錄激活、調(diào)節(jié)蛋白功能及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種生物學(xué)過程，并可調(diào)控惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲。研究表明長鏈非編碼RNA MIR4435-2HG（Long non-coding RNA MIR4435-2HG，LncRNA MIR4435-2HG）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯增高，并可通過調(diào)控微小RNA-487a（microRNA-487a，miR-487a）表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。但MIR4435-2HG在胰腺癌中的表達(dá)及其對胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程的影響尚未可知。相關(guān)報(bào)道指出微小RNA-1（microRNA-1，miR-1）在胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-1表達(dá)可以抑制胰腺癌內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管生成。通過starBase在線網(wǎng)站預(yù)測到微小RNA-1-3p（microRNA-1-3p，miR-1-3p）可能是MIR4435-2HG的靶基因，然而MIR4435-2HG是否可通過調(diào)控miR-1-3p表達(dá)進(jìn)而參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程尚未可知。已有報(bào)道指出磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路失活可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。然而，MIR4435-2HG是否可調(diào)控PI3K/Akt信號通路進(jìn)而影響胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲仍未可知。目前國內(nèi)外對MIR4435-2HG在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究相對較少，本研究于2017年1月至2018年12月通過抑制胰腺癌細(xì)胞中MIR4435-2HG表達(dá)，以研究其對胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及PI3K/Akt信號通路的影響，并首次探討胰腺癌細(xì)胞中MIR4435-2HG與miR-1-3p的靶向調(diào)控關(guān)系及其內(nèi)在作用機(jī)制，以期為揭示胰腺癌發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常胰腺細(xì)胞系hTERT-HPNE與胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、Bx-PC-3均購自美國ATCC細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清均購自杭州四季青生物材料有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；MIR4435-2HG干擾序列（siRNA MIR4435-2HG）與siRNA control均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-1-3p mimics、miR-1-3p抑制劑（anti-miR-1-3p）及其各自相應(yīng)無意義序列均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒及熒光素酶報(bào)告基因載體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國Sigma公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）與基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）抗體均購自美國Novus Biologicals公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p-Akt、PI3Kp11 0α、PI3Kp110β抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；蛋白裂解液與BCA蛋白檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 正常胰腺細(xì)胞系hTERTHPNE與胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、SW1990、Pa-Tu8988、BxPC-3均接種至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及時(shí)更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定傳代2～3代后進(jìn)行后續(xù)研究。選取生長狀態(tài)良好的胰腺癌PaTu8988細(xì)胞，以每孔2×10個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，將胰腺癌PaTu8988細(xì)胞按照隨機(jī)數(shù)字表法分為si-MIR4435-2HG組（轉(zhuǎn)染MIR4435-2HG siRNA）、si-con組（轉(zhuǎn)染siRNA Control）、miR-1-3p組（轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics）、miR-con組（轉(zhuǎn)染miR-1-3p陰性對照）、si-MIR4435-2HG+anti-miR-1-3p組（共轉(zhuǎn)染MIR4435-2HG siRNA與miR-1-3p抑制劑）、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con組（共轉(zhuǎn)染MIR4435-2HG siRNA與miR-1-3p抑制劑的陰性對照），同時(shí)將未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為NC組。轉(zhuǎn)染6 h后用含有10%胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基更換不含血清的培養(yǎng)基，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測細(xì)胞中LncRNA MIR4435-2HG與miR-1-3p的表達(dá)水平 分別收集各組細(xì)胞，用液氮低溫研磨細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min后向每管酶加入200μL氯仿，上下?lián)u晃15 s后置于室溫條件下靜置2 min，4℃，1 2000 r/min，離心10 min，吸取上層水相置于另一新的1.5 mL EP管內(nèi)，加入500μL異丙醇，充分混勻后室溫靜置7 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA，4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，超凈工作臺(tái)干燥7 min，加入30～40μL DEPC水，置于60℃恒溫水浴鍋3 min，目的是促使RNA完全溶解，吸取2μL RNA檢其濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），采用qRT-PCR檢測MIR4435-2HG與miR-1-3p的表達(dá)情況，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明配置25μL的反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL，cDNA樣本2μL，正反向引物各1μL，DEPC水補(bǔ)足體系至25μL。反應(yīng)條件為95℃2 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃20 s，循環(huán)35次，每孔均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后按照2法計(jì)算MIR4435-2HG與miR-1-3p的相對表達(dá)量。

1.2.3

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測cyclin D1、MMP2、MMP9及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min收集上清液即細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，煮沸蛋白促使其變性，同時(shí)制備濃縮膠與分離膠，蛋白樣本上樣，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，PVDF膜濕法將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至膜上，使用蛋白封閉液室溫條件下封閉1 h，加入蛋白一抗，稀釋比均為1∶100，4℃條件下孵育過夜，次日室溫條件下分別加入二抗，孵育1 h后置于凝膠成像系統(tǒng)曝光，應(yīng)用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期胰腺癌Pa-Tu8988細(xì)胞，胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×10/mL，以每孔4×10個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)分別檢測各孔吸光度值，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，檢測時(shí)各孔分別加入20μL MTT溶液，室溫孵育4 h后棄培養(yǎng)基，各孔分別加入200μL二甲基亞砜，振蕩10 min后置于酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度值。

1.2.5

細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組胰腺癌PaTu8988細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入200μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10/mL，同時(shí)用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠（稀釋比1∶8），取100μL稀釋液鋪于Transwell小室底部的上室面，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%的培養(yǎng)箱靜置1 h。將單細(xì)胞懸液以每孔5×10個(gè)細(xì)胞的密度平鋪于Transwell小室的上室，取600μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室并用棉簽擦去上室細(xì)胞，多聚甲醛固定20 min后使用結(jié)晶紫溶液染色15 min，預(yù)冷PBS洗滌后置于倒置顯微鏡下觀察穿過濾膜的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中Transwell小室的上室不涂Matrigel基質(zhì)膠稀釋液，其余步驟同Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.6

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用starbase對MIR4435-2HG和miR-1-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG的3"UTR上存在miR-1-3p的結(jié)合位點(diǎn)，提示MIR4435-2HG可能靶向結(jié)合miR-1-3p。構(gòu)建含有miR-1-3p結(jié)合位點(diǎn)的MIR4435-2HG-3"野生型（WT-MIR4435-2HG）及突變型報(bào)告基因載體（MUT-MIR4435-2HG），同時(shí)將對數(shù)生長期的胰腺癌PaTu8988細(xì)胞以每孔2×10個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前3 h將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，將miR-1-3p mimics與WTMIR4435-2HG共同轉(zhuǎn)染胰腺癌PaTu8988細(xì)胞，以共轉(zhuǎn)染miR-con為對照；將miR-1-3p mimics與MUTMIR4435-2HG共同轉(zhuǎn)染胰腺癌PaTu8988細(xì)胞，以共轉(zhuǎn)染miR-con為對照，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 qRT

-

PCR檢測胰腺癌細(xì)胞和正常胰腺細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA MIR4435

-

2HG和miR

-

1

-

3p表達(dá)量

在胰腺癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA MIR4435-2HG的表達(dá)水平較正常胰腺細(xì)胞系hTERT-HPNE明顯升高（

P

＜0.05），而miR-1-3p的表達(dá)水平顯著降低（

P

＜0.05），其中在胰腺癌PaTu8988細(xì)胞中miR-1-3p的表達(dá)水平降低最為明顯，因此選取胰腺癌PaTu8988細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，見表1。

表1 胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3和正常胰腺細(xì)胞系hTERT-HPNE中l(wèi)ncRNA MIR4435-2HG和miR-1-3p表達(dá)量比較/±s

2.2 敲低MIR4435

-

2HG對PaTu8988增殖、遷移和侵襲的影響

敲低MIR4435-2HG后，觀察胰腺癌PaTu8988細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力改變，如圖1、表2所示，與NC組、si-con組比較，si-MIR4435-2HG組PaTu8988細(xì)胞增殖活性顯著降低（

P

＜0.05），細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均明顯減少（

P

＜0.05），進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，si-MIR4435-2HG組PaTu8988細(xì)胞中cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平較NC組、si-con組均顯著降低（

P

＜0.05），表明敲低MIR4435-2HG可通過降低cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

2.3 MIR4435

-

2HG靶向miR

-

1

-

3p表達(dá)

通過starbase對MIR4435-2HG和miR-1-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖，見圖2。構(gòu)建含有miR-1-3p結(jié)合位點(diǎn)的MIR4435-2HG-3"野生型（WT-MIR4435-2HG）及突變型報(bào)告基因載體（MUT-MIR4435-2HG），在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics和MIR4435-2HG野生型及突變型報(bào)告基因載體，結(jié)果顯示，與miR-con組相比，轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics與WT-MIR4435-2HG后可明顯降低細(xì)胞熒光素酶活性（

P

＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics與MUT-MIR4435-2HG對細(xì)胞熒光素酶活性無明顯影響（

P＞

0.05），見表3。表明MIR4435-2HG可靶向結(jié)合miR-1-3p。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測MIR4435-2HG過表達(dá)或抑制其表達(dá)后，胰腺癌Pa-Tu8988細(xì)胞中miR-1-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與si-con組（0.96±0.09）相比，si-MIR4435-2HG組胰腺癌PaTu8988細(xì)胞中miR-1-3p的表達(dá)水平（2.19±0.23）顯著升高（

P

＜0.05）；與pcDNA-con組（0.99±0.11）相比，pcDNA-MIR4435-2HG組胰腺癌Pa-Tu8988細(xì)胞中miR-1-3p的表達(dá)水平（0.45±0.05）顯著 降 低（

P

＜0.05），

F

=86.417，

P

＜0.001。表 明MIR4435-2HG可負(fù)向調(diào)控靶基因miR-1-3p的表達(dá)。

表2 敲低MIR4435-2HG對PaTu8988胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響研究/±s

圖2 MIR4435-2HG靶向miR-1-3p表達(dá)，生物信息軟件預(yù)測MIR4435-2HG與miR-1-3p靶向關(guān)系

表3 miR-con或miR-1-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PaTu8988細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測結(jié)果比較/±s

2.4 高表達(dá)miR

-

1

-

3p對PaTu8988增殖、侵襲和遷移的影響研究

胰腺癌PaTu8988細(xì)胞中上調(diào)miR-1-3p表達(dá)后，觀察細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，結(jié)果顯示，相較于NC組、miR-con組，miR-1-3p組胰腺癌PaTu8988細(xì)胞增殖活性顯著降低（

P

＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（

P

＜0.05），能夠明顯抑制cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)（

P

＜0.05），見圖3、表4。表明胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-1-3p表達(dá)可通過下調(diào)cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)進(jìn)而減弱胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

圖3 高表達(dá)miR-1-3p蛋白質(zhì)印跡法檢測cyclin D1、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)

2.5 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測敲低MIR4435-2HG及上調(diào)miR-1-3p后胰腺癌PaTu8988細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，如圖4、表5所示，與si-con組相比，si-MIR4435-2HG組 與miR-1-3p組p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（

P

＜0.05），表明敲低MIR4435-2HG或上調(diào)miR-1-3p表達(dá)均可抑制PI3K/Akt信號通路活化。

圖4 Western blotting檢測敲低MIR4435-2HG及上調(diào)miR-1-3p后胰腺癌PaTu8988細(xì)胞中磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 Western blotting檢測敲低MIR4435-2HG及上調(diào)miR-1-3p后胰腺癌PaTu8988細(xì)胞中磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較/±s

2.6 miR

-

1

-

3p低表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)MIR4435

-

2HG低表達(dá)對PaTu8988增殖、侵襲和遷移的影響

為了驗(yàn)證敲低MIR4435-2HG是否可通過調(diào)控miR-1-3p表達(dá)進(jìn)而對胰腺癌PaTu8988細(xì)胞增殖、遷移及侵襲發(fā)揮抑制作用，將si-MIR4435-2HG與antimiR-1-3p、anti-miR-con分別共轉(zhuǎn)染入胰腺癌Pa-Tu8988細(xì)胞，如圖5、表6所示，與si-MIR4435-2HG+anti-miR-con組相比，si-MIR4435-2HG+anti-miR-1-3p組胰腺癌PaTu8988細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)（

P

＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增加（

P

＜0.05），明顯促進(jìn)cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)（

P

＜0.05）。表明抑制miR-1-3p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)敲低MIR4435-2HG表達(dá)對胰腺癌PaTu8988細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

表4 高表達(dá)miR-1-3p對PaTu8988胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響研究/±s

圖5 Western blotting檢測cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

3 討論

進(jìn)展期或晚期胰腺癌病人對化療藥物具有一定耐藥性而降低治療效果，病人經(jīng)治療后生存率極低。因而探究胰腺癌發(fā)病機(jī)制及其可能作用分子靶點(diǎn)對提高胰腺癌早期診斷及治療均具有重要意義。目前LncRNA可通過調(diào)控細(xì)胞分化、發(fā)育等過程進(jìn)而在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，并可為腫瘤治療提供新方向。有研究表明LncRNA MALAT1可通過調(diào)控miR-204表達(dá)進(jìn)而參與胰腺癌發(fā)生及發(fā)展過程，并可能作為胰腺癌靶向治療的靶點(diǎn)。但LncRNA與胰腺癌發(fā)展進(jìn)程的相關(guān)研究尚未完全闡明，因此繼續(xù)深入挖掘新型LncRNA分子并探討其與胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的相關(guān)性對提高治療效果及改善病人預(yù)后均具有重要臨床意義。

MIR4435-2HG在肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可通過激活β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)可促進(jìn)肺癌進(jìn)展。胃癌病人血漿中MIR4435-2HG的表達(dá)水平升高并可作為早期胃癌診斷的分子標(biāo)志物。Ouyang等研究表明MIR4435-2HG在結(jié)直腸癌病人中呈高表達(dá)，其高表達(dá)量與病人預(yù)后不良有關(guān)，并可作為預(yù)測病人預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。以上研究表明MIR4435-2HG可能作為癌基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等多種生物學(xué)過程，因此本研究探討MIR4435-2HG在胰腺癌細(xì)胞中的具體作用，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞系中MIR4435-2HG的表達(dá)水平均顯著升高，進(jìn)一步通過敲低MIR4435-2HG表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯受到抑制，并可降低cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)，說明MIR4435-2HG在胰腺癌生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。既往研究表明腫瘤增殖、遷移及侵襲與胰腺癌轉(zhuǎn)移早、進(jìn)展快等有關(guān)，抑制cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。提示抑制MIR4435-2HG表達(dá)可通過影響細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而影響胰腺癌惡性生物學(xué)行為。生物信息學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG與miR-1-3p存在相互作用，但其具體作用機(jī)制尚未可知。既往研究報(bào)道指出miR-1-3p可通過調(diào)控BDNF-TrKB信號通路及其他相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及侵襲。Wang等研究表明miR-1-3p通過靶向DKK1進(jìn)而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1-3p在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，提示miR-1-3p可能作為抑癌因子參與胰腺癌發(fā)生過程。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明MIR4435-2HG可靶向結(jié)合miR-1-3p，上游MIR4435-2HG可負(fù)向調(diào)控miR-1-3p表達(dá)，同時(shí)miR-1-3p可通過逆向調(diào)控MIR4435-2HG的表達(dá)進(jìn)而對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲進(jìn)行雙向調(diào)控，說明敲低MIR4435-2HG表達(dá)可通過調(diào)控miR-1-3p表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。提示MIR4435-2HG可通過與miR-1-3p相互作用進(jìn)而參與胰腺癌發(fā)生及發(fā)展過程，其可作為胰腺癌早期診斷的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

PI3K/Akt信號通路可參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等生物學(xué)過程，腫瘤細(xì)胞接受生長因子刺激后可活化受體酪氨酸酶并與PI3K結(jié)構(gòu)中的p85亞基結(jié)合進(jìn)而改變PI3K構(gòu)象，同時(shí)可激活A(yù)kt等發(fā)生磷酸化進(jìn)而促使其由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)最終促使靶基因MMP-2、cyclin D1等進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。劉江波等研究表明阻斷PI3K/Akt信號通路可通過抑制細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。相關(guān)研究報(bào)道指出激活PI3K/Akt信號通路可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中抑制MIR4435-2HG表達(dá)及miR-1-3p過表達(dá)后能夠明顯降低p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β蛋白表達(dá)水平，與相關(guān)研究報(bào)道相似。說明抑制MIR4435-2HG表達(dá)及miR-1-3p過表達(dá)均可抑制PI3K/Akt信號通路激活。提示當(dāng)機(jī)體遭受外界因素干擾或自身微環(huán)境變化時(shí)MIR4435-2HG表達(dá)上調(diào)而抑制miR-1-3p表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體處于病理狀態(tài)，并可破壞細(xì)胞自身平衡狀態(tài)進(jìn)而促使胰腺癌細(xì)胞突變導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生改變。

表6 MTT法檢測細(xì)胞增殖、Transwell檢測細(xì)胞侵襲和遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)比較/±s

綜上所述，MIR4435-2HG在胰腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，而miR-1-3p呈低表達(dá)，MIR4435-2HG可通過與miR-1-3p相互作用進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，推測其原因可能與PI3K/Akt信號通路活化狀態(tài)有關(guān)，可為胰腺癌早期診斷及靶向治療提供參考依據(jù)。但關(guān)于miR-1-3p是否通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)進(jìn)而構(gòu)建MIR4435-2HG/miR-1-3p/靶基因網(wǎng)絡(luò)均未可知，推測胰腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能存在MIR4435-2HG/miR-1-3p/靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。