肝癌是臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其病死率及患病率極高，以腫瘤細(xì)胞高度轉(zhuǎn)移性及侵襲性為主要病理基礎(chǔ)特征，由于肝癌發(fā)病較隱匿導(dǎo)致病人確診時(shí)已處于肝癌晚期導(dǎo)致手術(shù)治療效果差。因而探討肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制對(duì)肝癌分子診斷及靶向治療均具有重要意義。白細(xì)胞介素-18（IL-18）主要是由單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生且具有多種生物活性，研究表明IL-18可通過促進(jìn)NK細(xì)胞等產(chǎn)生炎性因子進(jìn)而參與感染、腫瘤等多種生理病理過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IL-18可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及遷移進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。研究表明IL-18在肝癌組織及細(xì)胞株中不表達(dá)或少量表達(dá)，并與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。IL-18能夠通過啟動(dòng)經(jīng)典的凋亡途徑誘導(dǎo)舌鱗癌細(xì)胞凋亡。然而，關(guān)于IL-18在肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未可知。柴紅濤等研究表明Wnt/β-連環(huán)素（β-catenin）信號(hào)通路活化可促進(jìn)肝癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展。研究表明維生素K2可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IL-18是否可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為尚未可知。本研究于2018年10月至2019年9月通過構(gòu)建IL-18過表達(dá)載體觀察IL-18表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用關(guān)系，為臨床診斷及治療肝癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝癌細(xì)胞株HepG2、Bel-7402購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；正常肝細(xì)胞株L02購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；pcDNA3.1載體與脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；IL-18、Bax、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中橋金衫生物公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Wnt/β-catenin通路激活劑（SKL2001）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2、Bel-7402、L02細(xì)胞，放入37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染前1 d更換不含胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-18（擴(kuò)增IL-18基因序列，擴(kuò)增區(qū)為IL-183"非翻譯區(qū)（UTR）的5"端63 bp至3"端871 bp，IL-18基因克隆到T-Vector，測(cè)序驗(yàn)證，用XbaⅠ與BamHⅠ雙酶切連接至XbaⅠ與BamHⅠ雙酶切的pcDNA3.1（+）得到pcDNA3.1-IL-18），分別將空載體（pcDNA3.1）與pcDNA3.1-IL-18轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，分別為pcDNA組、pcDNA-IL-18組。為了驗(yàn)證IL-18是否通過抑制Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用，因此本研究在pcDNA-IL-18組HepG2細(xì)胞中加入濃度為20μmol/L的SKL2001（pcDNA-IL-18+SKL2001組）。每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)將正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞作為Blank組。

1.2.2

qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-18、Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)水平 按照Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度與純度，取1μg RNA為模板按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃30 s。IL-18引物由上海生物工程股份有限公司合成，采用qRT-PCR檢測(cè)試劑盒，IL-18正向引物為5"-CGTTGTCACAGATAAAGAGCCAG-3"，反向引物為5"-TGACCAGGAGAGTGTACGACG-3"；Bax正向引物為5"-TTTCTGACGGCAACTTCAACTG-3"，反向引物為5"-CAACCACCCTGGTCTTGGAT-3"；Bcl-2正向引物為5"-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3"，反向引物為5"-GTTGACGCTCTCCACACACAT-3"。按照說明書配反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，cDNA 2μL，上反向引物各0.8μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，雙蒸水（ddHO）6μL以此檢測(cè)IL-18、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)；反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)，IL-18、Bax、Bcl-2均以GAPDH為內(nèi)參，使用ABI 7500熒光定量PCR儀分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以2法計(jì)算IL-18、Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)IL-18、Bax、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá) 預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞后分別加入RIPA蛋白裂解液（400μL），裂解時(shí)間為30 min，4℃條件下經(jīng)離心機(jī)離心30 min，提取細(xì)胞總蛋白，配置SDSPAGE凝膠，分別取蛋白樣品與上樣緩沖液混合液上樣，電泳反應(yīng)條件依次為80 V 30 min，120 V 90 min，根據(jù)marker位置切膠并應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜儀將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），依次加入5%脫脂奶粉、1×TBS、吐溫-20（0.1%）室溫條件下封閉3 h，分別加入IL-18（1∶400）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、β-catenin（1∶500）、Cyclin D1（1∶500）一抗，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光顯影，置于凝膠成像分析系統(tǒng)及應(yīng)用Quantityone軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.4

MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以每孔100μL體積接種至96孔板（濃度為3×10/L），在37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%、相對(duì)濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，分別加入MTT試劑（20微升/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔分別加入150μL DMSO，搖床振蕩10 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔相對(duì)吸光度。

1.2.5

Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×10/L，PBS清洗，棄上清，分別加入預(yù)冷的100μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，依次加入10μL Annexin V-FITC與10μL PI，混勻后避光孵育15 min，應(yīng)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 IL

-

18在肝癌HepG2、Bel

-

7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá)

由圖1、表1可知，與正常肝細(xì)胞L02相比，肝癌HepG2、Bel-7402細(xì)胞中IL-18 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低（

P

＜0.05）。HepG2細(xì)胞中IL-18 mRNA及蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低，因此本研究選取HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 正常肝細(xì)胞L02和肝癌HepG2、Bel-7402細(xì)胞IL-18蛋白免疫印跡圖

表1 白細(xì)胞介素-18（IL-18）在肝癌HepG2、Bel-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá)/±s

2.2 過表達(dá)IL

-

18對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IL-18過表達(dá)載體（pcDNAIL-18），Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-18蛋白表達(dá)明顯升高（

P

＜0.05），表明成功提高HepG2細(xì)胞中IL-18表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于pcDNA組，培養(yǎng)48 h、72 h時(shí)pcDNA-IL-18組HepG2細(xì)胞吸光度值均顯著降低（

P

＜0.05），見圖2、表2。表明IL-18過表達(dá)可抑制HepG2細(xì)胞增殖。

圖2 各組肝細(xì)胞IL-18蛋白免疫印跡圖

表2 過表達(dá)白細(xì)胞介素-18（IL-18）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響/±s

2.3 過表達(dá)IL

-

18對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡情況，Blank組、pcDNA組、pcDNA-IL-18組HepG2細(xì)胞凋亡率分別為（5.87±0.19）%、（6.93±0.22）%、（20.54±3.97）%（

F

=190.070，

P

＜0.001），pcDNA-IL-18組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于pcDNA組（

P

＜0.05），見圖3。

2.4 過表達(dá)IL

-

18對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

為明確IL-18是否通過調(diào)控線粒體凋亡途徑進(jìn)而促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，采用qRTPCR與Western blotting分別檢測(cè)HepG2細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示pcDNA-IL-18組HepG2細(xì)胞Bax mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于pcDNA組（

P

＜0.05），而Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低（

P

＜0.05），見圖4、表3。表明IL-18可通過上調(diào)Bax表達(dá)及下調(diào)Bcl-2表達(dá)進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.5 過表達(dá)IL

-

18對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞Wnt/

β

catenin通路的影響

用Western blotting檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA-IL-18組HepG2細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)均顯著低于pcDNA組（

P

＜0.05），見圖5、表4。表明IL-18可能通過抑制Wnt/β-catenin通路進(jìn)而參與肝癌發(fā)生及發(fā)展過程。

圖4 各組肝細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡圖

表3 過表達(dá)白細(xì)胞介素-18（IL-18）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響/±s

圖5 各組肝細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1蛋白免疫印跡圖

表4 過表達(dá)白細(xì)胞介素-18（IL-18）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的影響/±s

2.6 Wnt/

β-

catenin通路激活劑（SKL2001）逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)IL

-

18對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用

為了驗(yàn)證IL-18是否通過抑制Wnt/β-catenin通路而發(fā)揮作用，在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-IL-18 12h后加入Wnt/β-catenin通路激活劑（SKL2001），結(jié)果顯示，IL-18過表達(dá)后細(xì)胞吸光度明顯降低（

P

＜0.05），而細(xì)胞凋亡率明顯升高（

P

＜0.05），但加入SKL2001激活劑后，與pcDNA-IL-18組相比，pcDNAIL-18+SKL2001組HepG2細(xì)胞吸光度明顯增加（

P

＜0.05），而細(xì)胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05），見表5。表明IL-18可通過抑制Wnt/β-catenin通路進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

表5 SKL2001逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)白細(xì)胞介素-18（IL-18）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的作用/±s

3 討論

肝癌早期診斷及治療手段均逐步提高但治療效果不佳，因而積極預(yù)防與尋找有效治療方法成為重點(diǎn)問題。肝癌細(xì)胞增殖與凋亡失衡是促進(jìn)該疾病發(fā)生及發(fā)展的重要原因，通過抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡是干預(yù)癌癥進(jìn)展的有效手段。研究表明Th1、Th2等免疫微環(huán)境細(xì)胞因子表達(dá)異常可參與多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。因此積極探究與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞因子對(duì)肝癌精準(zhǔn)治療及提高病人生存率均具有重要意義。

IL-18主要作用于NK細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞，研究顯示IL-18在卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中均呈低表達(dá)，上調(diào)IL-18表達(dá)可抑制腫瘤發(fā)生及發(fā)展，進(jìn)一步探究其可能作用機(jī)制為IL-18可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞分化過程并促進(jìn)由Fas-FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。但不少研究顯示IL-18可通過促進(jìn)腫瘤新生血管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展。然而，IL-18在肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示肝癌HepG2、Bel-7402細(xì)胞中IL-18均呈低表達(dá)，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IL-18在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較低，因此在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IL-18過表達(dá)質(zhì)粒，初步分析IL-18過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示IL-18過表達(dá)后HepG2細(xì)胞增殖活性明顯降低，而細(xì)胞凋亡率明顯升高，進(jìn)一步分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-18過表達(dá)后HepG2細(xì)胞Bax表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡受Bax、Bcl-2蛋白調(diào)控，Bcl-2/Bax與Bcl-2/Bcl-x1形成二聚體時(shí)可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax自身形成二聚體時(shí)可通過激活線粒體凋亡途徑進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示IL-18過表達(dá)可通過激活線粒體凋亡途徑進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及黏附等多種細(xì)胞生物學(xué)行為，研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)乳腺癌、肝癌及結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。Wnt蛋白可激活GSK-3β發(fā)生磷酸化進(jìn)而促使β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并可激活下游靶基因Cyclin D1等靶基因進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞增殖及遷移能力。研究表明腫瘤細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)量升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，其表達(dá)水平越高預(yù)示腫瘤惡性程度越高。研究表明通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制肝癌細(xì)胞增殖。由此猜測(cè)IL-18是否可通過調(diào)控Wnt/βcatenin信號(hào)通路進(jìn)而參與肝癌發(fā)生及發(fā)展過程，本研究結(jié)果顯示IL-18過表達(dá)后HepG2細(xì)胞Wnt/βcatenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1的表達(dá)水平均顯著降低，說明IL-18過表達(dá)可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化。提示IL-18可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而影響肝癌發(fā)生及發(fā)展過程。同時(shí)本研究進(jìn)一步驗(yàn)證IL-18通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示IL-18過表達(dá)后加入Wnt/βcatenin信號(hào)通路激動(dòng)劑可明顯逆轉(zhuǎn)IL-18過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制及細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示IL-18可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中βcatenin表達(dá)并下調(diào)下游蛋白Cyclin D1進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，IL-18在肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)IL-18表達(dá)可通過激活線粒體凋亡途徑與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機(jī)制尚未完全闡明，關(guān)于肝癌遷移及侵襲的分子機(jī)制仍有待研究。