炎癥反應(yīng)與機體息息相關(guān)，既是人體重要的自我防御機制，也是大多數(shù)急慢性疾病的來源。研究表明，炎癥參與了臨床大多數(shù)疾病的發(fā)展變化，包括肺炎、膿毒血癥、酒精性肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病和腫瘤等。雙黃連由金銀花、黃芩、連翹三味藥材組成，廣泛應(yīng)用于臨床。現(xiàn)代藥理學研究表明，三味藥材都具有抗菌抗病毒，解熱抗炎，保肝抗氧化，免疫調(diào)節(jié)等作用；其中，據(jù)報道黃芩和連翹還具有抗腫瘤作用；黃芩具有抗缺血再灌注損傷的作用。盡管目前對于雙黃連制劑抗炎作用機制的研究已有大量報道，但在有效成分、靶點以及通路上對其整體的藥理作用機制尚未完全闡明。

中藥所含成分復雜，多個靶點協(xié)同發(fā)揮作用，在治療很多疾病方面有不可取代的作用。正因為多組分協(xié)同作用的特點，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制更為復雜，如何科學系統(tǒng)地研究其藥理作用機制是中藥現(xiàn)代化的難點之一。網(wǎng)絡(luò)藥理學基于多向藥理學、系統(tǒng)生物學，利用網(wǎng)絡(luò)建模的方法，從系統(tǒng)的角度出發(fā)，綜合分析主要藥效成分、潛在作用靶點和分子機制之間的相互聯(lián)系，與中醫(yī)整體觀念相呼應(yīng)。本研究于2018年8月至2019年11月根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學研究思路綜合分析雙黃連口服制劑的主要藥效成分和可能的分子機制，以期為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建雙黃連口服制劑的化學成分數(shù)據(jù)庫

根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine system pharmacology platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“金銀花”“黃芩”“連翹”為關(guān)鍵詞檢索這三味藥材的全部化學成分，其中金銀花含有236個，黃芩含有143個，連翹含有150個，金銀花和黃芩含有的相同成分18個，金銀花和連翹含有的相同成分21個，黃芩和連翹含有的相同成分11個，三味藥材共有的化學成分有4個，故而“金銀花-黃芩-連翹”中含有的所有相關(guān)化學成分共482個。

1.2 活性化合物的篩選

藥物在體內(nèi)需經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄的過程，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是指藥物口服后到達體循環(huán)的相對量，高口服生物利用度是藥物是否具有生物活性的一個重要指標；類藥性代表化合物與已知藥物的相似性，類藥性≥0.18表示該成分與Drugbank數(shù)據(jù)庫里藥物具有一定的相似性；Caco-2細胞結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞，Caco-2細胞滲透率決定人體吸收藥物的生物利用度。本研究以口服生物利用度閾值OB≥30%，類藥性≥0.18，Caco-2細胞滲透率≥0.4作為篩選條件，通過評價化合物的體內(nèi)過程選擇生物活性較高的化合物。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫尋找42個活性成分的潛在作用靶點，并將靶點數(shù)據(jù)通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），選擇物種為人，進行歸一化和標準化命名，最終得到三味藥材活性成分的潛在靶點為141個。利用Cytoscape3.6.1軟件將活性化合物與其潛在靶點蛋白生成（Compound-target，C-T）網(wǎng)絡(luò)圖。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，探究三味藥材的藥理作用機制及機理。

1.4 炎性疾病靶點的篩選

通過比較基因組學數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https：//ctdbase.org/），以“inflammation”為關(guān)鍵詞檢索與炎癥相關(guān)的基因。

1.5 蛋白互作（protein

-

protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在生化過程中，蛋白往往通過相互作用形成大分子復合物來完成其生物學過程。通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），獲取上述雙黃連和炎癥相關(guān)的交集靶蛋白在系統(tǒng)水平的相互作用信息。將可信度設(shè)為≥0.7，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并對結(jié)果進行分析。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，用FDR錯誤控制法（FDR＜0.05）對P值做檢驗校正，設(shè)定閾值P＜0.05，得到潛在靶點參與表達的生物學通路，探究雙黃連的藥理作用機制。

1.7 成分

-

靶點

-

信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集蛋白與其相關(guān)聯(lián)的藥對中成分，構(gòu)建成與炎癥相關(guān)的雙黃連化學成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。交集蛋白與KEGG富集出的生物通路構(gòu)建出炎癥靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.6.1軟件中的合并功能將以上兩種網(wǎng)絡(luò)合并，從而得出成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 化合物的篩選

符合篩選條件的化合物共有55個。其中，JYH7（豆甾醇，Stigmasterol）是金銀花和黃芩共有成分，HQ2（漢黃芩素，wogonin）是黃芩和連翹共有成分，三者都含有JYH6（β-谷甾醇，betasitosterol）。有9個化學成分沒有相應(yīng)的作用靶點，所以共有42個化學成分符合篩選條件，其中金銀花7個，黃芩24個，連翹11個，見表1。

2.2 化合物靶點篩選

通過TCMSP平臺檢索這42個活性化合物的潛在作用靶點，共得到141個靶點。將這些成分與靶點通過Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，得到的網(wǎng)絡(luò)圖包括163個節(jié)點。節(jié)點的度（degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連的路線的條數(shù)，度值越大表明節(jié)點越重要。從表2中可以看出，度值較大（度值≥25）的化合物為HQ2，HQ4（黃芩素，baicalein），JYH6，JYH7；度值較大的邊（度值≥25）前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2），前列腺素G/H合成酶1（Prostaglandin G/Hsynthase 1，PTGS1）等。

表1 雙黃連中含有的42個與炎癥相關(guān)的化合物信息

2.3 雙黃連與炎癥交集靶點

分別利用TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫查詢出雙黃連候選化合物141個靶點，炎癥417個相關(guān)基因。其中雙黃連與炎癥的共有基因53個，即雙黃連候選化合物作用靶點與炎癥共有53個交集蛋白。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，通過相關(guān)設(shè)置，得到53個交集蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中共有53個節(jié)點，397條邊，平均度值為15。其中節(jié)點代表交集蛋白，邊則表示蛋白間的關(guān)聯(lián)作用，線條的粗細表示關(guān)聯(lián)度的大小。

2.5 GO功能富集分析

在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫中對PPI網(wǎng)絡(luò)中得到53個靶點進行GO功能富集分析，共得到519條GO條目。在這些生物過程里，根據(jù)FDR錯誤控制法（FDR≤0.05）確定了77個GO條目。其中，這些條目中包含58個生物過程的條目，11個分子功能的條目，8個細胞組成的條目，主要參與酶結(jié)合，血管生成，激素調(diào)節(jié)，細胞凋亡，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，缺氧，衰老等。見圖2。

2.6 KEGG通路富集分析

利用David 6.8數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡(luò)中53個靶蛋白基因進行KEGG通路富集分析，共有90條生物通路，其中錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR≤0.05的有46條。其中包括Pathways in cancer，Hepatitis B，Colorectal cancer，Proteoglycans in cancer，TNF signaling pathway，Apoptosis，Small cell lung cancer，p53 signaling pathway等。根據(jù)P值排序，前30個生物通路見圖3。

2.7 成分

-

靶點

-

信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

整理炎癥相關(guān)的成分靶點關(guān)聯(lián)信息及相關(guān)靶點通路關(guān)聯(lián)信息，并將關(guān)聯(lián)信息上傳至Cytoscape 3.6.1軟件中，并利用該軟件的合并功能構(gòu)建雙黃連活性成分-作用靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。圖中包括成分36種，用三角形表示；炎癥相關(guān)靶點53個，用橢圓形表示；信號通路30條，用長方形表示。篩選出的雙黃連候選活性成分的作用靶點分布在不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮抗炎作用。

其中，根據(jù)度值前五位的化合物為HQ2，HQ4，JYH3（β-胡蘿卜素，beta-carotene），HQ1（金合歡素，acacetin），HQ9（千層紙素A，oroxylin A），見表3；度值前五位的靶點為PTGS2，PTGS1，誘導型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible，NOS2），轉(zhuǎn)錄因子p65（Transcription factor p65，RELA），外消旋-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1），見表4。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，篩選出雙黃連抗炎的36個活性成分、53個交集靶點和30條信號通路。通過分析成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)度值前五位的化學成分為黃芩素、漢黃芩素，β-胡蘿卜素，金合歡素，千層紙素A，可能是雙黃連抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。黃芩素快速抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）的釋放，導致白細胞介素-6（IL-6）和一氧化氮的減少發(fā)揮抗炎作用。黃芩素通過PI3K/Akt信號通路，保護糖尿病心肌病大鼠免受氧化應(yīng)激和心肌組織炎癥的損害。漢黃芩素通過抑制一氧化氮，細胞因子，趨化因子和生長因子在巨噬細胞中發(fā)揮抗炎作用。漢黃芩素通過抑制Akt磷酸化，減少中性粒細胞浸潤，促炎細胞因子的產(chǎn)生，黏附分子表達來治療急性肺損傷。β-胡蘿卜素能夠抑制活性氧（ROS）介導的炎癥信號，并減少炎癥介質(zhì)在感染組織中的表達，包括白細胞介素-8（IL-8），NOS2和環(huán)氧化酶-2（COX-2）。金合歡素通過干擾PI3K/Akt/IKK和MAPK的活化，從而下調(diào)巨噬細胞中炎性NOS2和COX-2基因的表達來預(yù)防炎癥相關(guān)腫瘤發(fā)生。金合歡素通過抑制炎癥細胞因子Toll樣受體4（TLR4），IL-6和TNF-α的釋放，從而減少缺血/再灌注誘導的心肌細胞凋亡，表明其可作為治療急性冠狀動脈綜合征患者的新藥。千層紙素A通過抑制COX-2蛋白的表達，一氧化氮、前列腺素E2的產(chǎn)生來抑制炎癥反應(yīng)。以上報道證實了雙黃連中黃芩素、漢黃芩素，β-胡蘿卜素，金合歡素，千層紙素A五種成分的抗炎活性，我們的研究結(jié)果與其一致。度值前五位的靶點為PTGS2、PTGS1、NOS2、RELA、AKT1。PTGS前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶，分為結(jié)構(gòu)型PTGS1和誘導型PTGS2，PTGS1參與機體正常的生理功能；PTGS2作為炎癥誘導的氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶，在多種體內(nèi)外因素誘導下生成的主要產(chǎn)物前列腺素，是重要的炎癥介質(zhì)，參與炎癥發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。NOS2在細胞受到細胞因子或免疫微生物刺激時，催化產(chǎn)生大量一氧化氮，過多的一氧化氮通常會引起炎癥、疼痛、免疫紊亂等癥狀。RELA基因在調(diào)控炎癥的NF-κB信號通路中起著極其重要的作用，但尚未有研究報道雙黃連通過對RELA基因的調(diào)控來發(fā)揮藥理作用，因此此結(jié)果待進一步確認。AKT1基因調(diào)節(jié)細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細胞過程，AKT1的異常表達與癌癥有關(guān)。除RELA基因外，已有研究顯示其他幾個基因與雙黃連發(fā)揮抗炎作用息息相關(guān)。

表2 雙黃連化合物-炎癥靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點及拓撲學性質(zhì)

表3 雙黃連抗炎成分-靶點-信號網(wǎng)絡(luò)中化學成分的節(jié)點及拓撲學性質(zhì)（前12）

表4 雙黃連抗炎成分-靶點-信號網(wǎng)絡(luò)中靶點的節(jié)點及拓撲學性質(zhì)（前12）

通過對53個交集靶點的GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，GO功能富集主要表現(xiàn)在對酶和激素的調(diào)節(jié)、血管生成，細胞凋亡，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程和分子功能上。KEGG通路富集分析中，很多基因富集到癌癥信號通路上如Pathways in cancer，Proteoglycans in cancer，Colorectal cancer，Small cell lung cancer。已有研究表明雙黃連中黃芩素通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達和上調(diào)P53途徑相關(guān)蛋白來抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖。漢黃芩素能夠上調(diào)凋亡蛋白的表達，抑制PI3K/AKT和STAT3信號轉(zhuǎn)導途徑通過自噬和凋亡細胞死亡抑制結(jié)直腸癌細胞的生長。千層紙素A能使細胞周期停滯在G2/M期來抑制結(jié)腸癌的發(fā)展。目前，未曾有雙黃連治療小細胞肺癌的報道，此結(jié)果有待進一步臨床驗證。在Hepatitis B信號通路中，Guo等研究發(fā)現(xiàn)雙黃連中黃芩素可顯著抑制乙型肝炎病毒DNA聚合酶，在體內(nèi)和體外均具有抗乙型肝炎病毒的活性。本研究可能為其治療乙型肝炎進一步的分子機制研究提供了基礎(chǔ)。本研究顯示，還有一些基因富集到了Apoptosis信號通路，p53 signaling pathway，TNF signaling pathway中。李彥林等研究發(fā)現(xiàn)雙黃連通過引起細胞凋亡的途徑來抑制大鼠白血病細胞增殖。雙黃連中漢黃芩素和黃芩素降低抗凋亡因子B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）的表達，通過p53依賴性方式通過人結(jié)腸癌細胞的Akt激活誘導凋亡。漢黃芩素具有抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡和抑制血管生成的能力，其分子機制涉及活性氧，Ca，NF-κB，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體和腫瘤壞死因子。在激素相關(guān)的信號通路Thyroid hormone signaling pathway和Estrogen signaling pathway中，有結(jié)果表明雙黃連中黃芩素通過誘導凋亡和自噬來抑制未分化的甲狀腺癌細胞的生長。但未見雙黃連通過調(diào)節(jié)甲狀腺激素發(fā)揮作用的報道，因此此結(jié)果仍需進一步驗證。雙黃連中漢黃芩素通過抑制雌激素受體和刺激內(nèi)皮細胞中一氧化氮和NOS2的表達而發(fā)揮抗炎作用。此項結(jié)果顯示雙黃連通過抑制雌激素受體來發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，由于中藥發(fā)揮藥效通過多成分、多靶點、多途徑的特點，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學思路，對雙黃連的復雜網(wǎng)狀關(guān)系進行分析。預(yù)測了雙黃連的主要藥效成分、潛在作用靶點和機制，對雙黃連進一步的分子機制研究具有參考價值。然而，由于化合物篩選沒有考慮到量的影響和配伍變化，獲取信息的數(shù)據(jù)庫不全面性和滯后性，本研究存在一定的局限性。

圖1 雙黃連與炎癥的交集靶蛋白蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)

圖2 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)中靶標的基因本體（GO）富集條形圖

圖3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)靶點KEGG富集氣泡圖（前30）

圖4 雙黃連抗炎成分-靶點-信號通路