楊艷平 楊麗文 烏蘭 繆麗梅 羅旭光

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2 包頭黃河國家濕地公園管理處，內(nèi)蒙古包頭 010010；3 內(nèi)蒙古自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是1種閉合、環(huán)狀的雙鏈 DNA 分子，具有進(jìn)化速度快、分子量小、結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定、便于研究等特點，是研究種群遺傳結(jié)構(gòu)的理想材料[1-2]。線粒體控制區(qū)又稱D-環(huán)區(qū)(D-loop)，為非編碼區(qū)，是整個線粒體基因組變異最快和長度變異最大的區(qū)域[3]，具有進(jìn)化速度快、遺傳變異大的特點[4]。近年來許多學(xué)者以測序技術(shù)為基礎(chǔ)，以D-loop作為分子標(biāo)記對魚類遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了廣泛研究[5-8]，這對于魚類種群保護(hù)和管理具有重要的意義。

大鰭鼓鰾鰍[Hedinichthysyarkandensismacroptera(Herzenstein)]隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、條鰍亞科(Nemacheilinae)、鼓鰾鰍屬(Hedinichthys)，是1種較為古老的大型鰍科魚類，屬于內(nèi)蒙古地區(qū)特有的魚類資源，在當(dāng)?shù)厮追Q“大頭魚”。該魚為底棲魚類，通常在湖泊深處活動，主要以小型魚類、蝦、各類水蚤和水生昆蟲為食[9]，目前僅分布在我國第二大內(nèi)陸河黑河的中下游水域，且較為集中地分布于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟額濟納旗境內(nèi)的居延海(蘇泊淖爾)。20世紀(jì)60年代，內(nèi)蒙古境內(nèi)黑河斷流造成居延海干涸，大鰭鼓鰾鰍在該地區(qū)幾近絕跡。2004年，隨著黑河改水工程的進(jìn)行，居延海正式蓄水，大鰭鼓鰾鰍又在居延海出現(xiàn)，并有小規(guī)模的產(chǎn)量。大鰭鼓鰾鰍肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具有生長較快、抗寒抗堿能力強、適應(yīng)性強等優(yōu)點，是內(nèi)蒙古等西北地區(qū)高寒高鹽堿湖泊的理想養(yǎng)殖對象，對于高鹽堿水體資源開發(fā)具有重要的意義。目前已有大鰭鼓鰾鰍生物學(xué)特性及人工繁殖方面的報道[10-13]，但運用D-loop區(qū)序列分析大鰭鼓鰾鰍種群遺傳多樣性的研究鮮見報道。本研究運用線粒體D-loop區(qū)序列對采自內(nèi)蒙古居延海及附近水域的52個大鰭鼓鰾鰍樣本進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳分化分析，為開展內(nèi)蒙古地區(qū)野生魚類遺傳資源調(diào)查、豐富該地區(qū)淡水魚類種質(zhì)資源基礎(chǔ)數(shù)據(jù)提供支持，同時為保護(hù)大鰭鼓鰾鰍物種生態(tài)穩(wěn)定性和遺傳多樣性，以及后續(xù)資源保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用大鰭鼓鰾鰍共52尾，采自內(nèi)蒙古居延海及附近水域。對試驗魚進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量、稱量、編號，活體解剖后，取其肝臟等組織器官儲存于95%乙醇溶液中，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取和鑒定

將保存的標(biāo)本取出，置于無菌蒸餾水中浸泡3 h以上。用組織勻漿儀將組織打碎，取勻漿后的組織約100 μg，采用Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取基因組DNA。用微量紫外分光光度計測量基因組DNA在260 nm和280 nm處的吸光度以及質(zhì)量濃度。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和純度。

1.3 引物設(shè)計

設(shè)計擴增D-loop區(qū)域的引物[14-15]，上游引物序列為DF1：5'-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3'；下游引物序列為DR2：5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'。所有引物由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.4 PCR擴增和序列測定

序列擴增試劑使用Takara Premix PrimeSTAR HS。反應(yīng)總體積50 μL：PCR Premix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，滅菌水22 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共25個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下將擴增良好的條帶進(jìn)行切膠回收，用天根DP209-03柱式膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司(上海)進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對測定的DNA序列進(jìn)行人工校正，采用DNAMAN 5.2.2軟件進(jìn)行個體和魚類群體間的序列比對，分析序列的核苷酸堿基組成、位點變異；采用MEGA 5.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹、遺傳距離、GC含量等分析。利用DnaSP v5軟件分析基因多態(tài)性及單倍型，獲得群體序列遺傳多樣性參數(shù)，包括單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)。

2 結(jié)果和分析

對52個標(biāo)本的D-loop區(qū)進(jìn)行了序列測定，得到約947 bp的序列片段，電泳顯示擴增條帶單一，未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶，試驗結(jié)果重復(fù)性較好，無外源 DNA 污染(見圖1)。

2.1 D-loop序列特征分析

2.1.1 堿基含量分析

在947 bp的D-loop序列中，堿基A、T、C、G的平均含量分別為34.5%、28.0%、21.3%、16.2%，其中G+C堿基平均含量(37.5%)明顯低于A+T堿基含量(62.5%)，具有明顯的堿基組成偏向性。具體結(jié)果見表1。

表1 大鰭鼓鰾鰍所測樣本的線粒體D-loop區(qū)的G+C含量

2.1.2 序列變異分析

在52個樣本中發(fā)現(xiàn)D5、D8、D9、D11、D12、D14、D17、D19、D21、D22、D23、D24、D25、D26、D32、D33、D34、D35、D36、D40、D41、D42、D43、D46、D49、D50、D51等27個樣本在645位點均缺失C堿基，突變總數(shù)為21；D-loop序列存在多態(tài)性位點/突變位點20個，單倍型數(shù)(h)為17，單倍型多樣性(Hd)為0.912，核苷酸多樣性(π)為0.0045。

2.2 遺傳多樣性和遺傳分化

2.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MEGA 5.1軟件的Maximum Likelihood方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，樣本共分為2支，對應(yīng)的樣本數(shù)分別為31和21個，說明大鰭鼓鰾鰍群體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定的遺傳分化(見圖2)。

2.2.2 遺傳距離計算分析

遺傳距離計算結(jié)果顯示，52個樣本的D-loop區(qū)的平均遺傳距離小于0.010，說明個體間的親緣關(guān)系較近。

3 討論

作為內(nèi)蒙古地區(qū)的特有魚類，大鰭鼓鰾鰍是該地區(qū)生物多樣性的重要組成部分[10]。同時，作為當(dāng)?shù)亍百p胡楊林，品大頭魚”的旅游特色之一，大鰭鼓鰾鰍也是當(dāng)?shù)刈钪匾慕?jīng)濟魚類之一。因此，對大鰭鼓鰾鰍開展資源保護(hù)顯得尤為重要。

大鰭鼓鰾鰍D-loop區(qū)堿基組成為A(34.5%)、T(28.0%)、C(21.3%)、G(16.2%)，堿基呈現(xiàn)不均一的分布，其中G+C堿基的平均含量(37.5%)顯著低于A+T堿基的含量(62.5%)，具有明顯的堿基組成偏向性。這與其他魚類線粒體DNA的蛋白質(zhì)編碼基因的特點一致[16-18]。

遺傳多樣性(genetic diversity)是生物多樣性的重要組成部分，與物種的適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力等密切相關(guān)[19-20]。掌握物種的遺傳多樣性水平可以為制訂針對性的保護(hù)和管理策略提供科學(xué)依據(jù)[21]。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)是進(jìn)行遺傳多樣性研究的2個重要參數(shù)[22]。本研究針對內(nèi)蒙古大鰭鼓鰾鰍線粒體D-loop區(qū)序列進(jìn)行分析，分析其群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，基于D-loop 區(qū)的大鰭鼓鰾鰍的單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)分別為17、0.912和0.004 5，顯示出較高的遺傳多樣性。與大鰭鼓鰾鰍Cytb基因序列相比，基于 D-loop 區(qū)序列的種群突變位點數(shù)以及多態(tài)性位點的比例要高于Cytb基因[23]。這說明D-loop區(qū)序列與Cytb基因相比，發(fā)生突變的位點更多，突變機率更高，可能是因為魚類的線粒體 D-loop 區(qū)序列所受的選擇壓力較小、進(jìn)化速率較快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進(jìn)化速度相對較慢[14]。

Grant等[24]根據(jù)Hd和π，分別以0.5和0.005為界限，將魚類進(jìn)化情景分為 4 種類型：低Hd和低π，高Hd和低π，低Hd和高π，低Hd和低π。整體來看，基于 D-loop 區(qū)序列的大鰭鼓鰾鰍的遺傳多樣性呈現(xiàn)出高Hd和低π的特征，其高Hd的特征接近于遺傳多樣性較豐富的長薄鰍(Hd=0.916)[25]、長江上游特有魚類紅唇薄鰍(Hd=0.967)[26]和高郵湖湖鱭(Hd=0.906)[27]等，而高于北江大刺鰍(Hd=0.541)[8]和異鰾鰍魚它(Hd=0.817)[28]；其低π的特征高于異鰾鰍魚它(π=0.002)，與長薄鰍(π=0.004 50)[25]相同，低于紅唇薄鰍(π=0.006 7)[26]、高郵湖湖鱭(π=0.006 27)[27]及北江大刺鰍(π=0.008 17)[8]等。由此可見，內(nèi)蒙古地區(qū)大鰭鼓鰾鰍種群的mtDNA D-loop序列表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。有學(xué)者推測，類似的遺傳多樣性現(xiàn)狀可能是由1個較小的有效種群經(jīng)歷“瓶頸效應(yīng)”或“建群效應(yīng)”后迅速增長而造成的，盡管變異導(dǎo)致了單倍型多態(tài)性的積累，但還未能導(dǎo)致其核苷酸序列多樣化的積累[29-30]。

20世紀(jì)60年代，黑河斷流造成西居延海干涸，至1992年，居延海也相繼干涸，使大鰭鼓鰾鰍在這一主要分布地區(qū)幾近絕跡。2002年，為保護(hù)西北地區(qū)生態(tài)環(huán)境和治理黑河流域，黑河改水工程開始實施。2004年居延海正式蓄水后，大鰭鼓鰾鰍又出現(xiàn)了，并有小規(guī)模的產(chǎn)量。但由于蓄水時間短，魚類資源還未能完全恢復(fù)和有效增加，大鰭鼓鰾鰍種群總體數(shù)量仍較小，尤其大型個體較少，與居延海干涸前的群體規(guī)模差距很大。人類的經(jīng)濟活動和酷漁濫捕，以及不科學(xué)的養(yǎng)殖方式和繁殖技術(shù)等嚴(yán)重破壞了大鰭鼓鰾鰍種群的多樣性，嚴(yán)重威脅到該物種的生存。因此，應(yīng)加強對大鰭鼓鰾鰍種質(zhì)資源的評估，加大保護(hù)力度，進(jìn)行合理的開發(fā)利用，以保持其遺傳多樣性，增大該資源恢復(fù)和提純復(fù)壯的機會。