于愛清 施永海 徐嘉波

(上海市水產(chǎn)研究所，上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

刀鱭(Coiliaectenes)又名長頜鱭，俗稱刀魚、毛刀魚，隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鱭屬(Coilia)，富含以γ-氨基酸為代表的活性氨基酸和不飽和脂肪酸，具有較高的經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)和養(yǎng)殖價(jià)值。歷史上我國長江刀鱭的自然種質(zhì)資源極為豐富，加上其漁汛相對穩(wěn)定，因而成為長江流域中下游的重要捕撈對象。近年來，由于酷漁濫捕、水域環(huán)境污染、水文條件改變、生態(tài)環(huán)境惡化和海岸工程建設(shè)等因素，長江刀鱭的自然種質(zhì)資源急劇衰退，年捕獲量波動(dòng)很大，呈現(xiàn)出年獲量逐年降低且個(gè)體小型化的趨勢，甚至無法形成優(yōu)勢種群，對刀鱭種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)和恢復(fù)已迫在眉睫[1-2]。隨著我國刀鱭規(guī)?；斯し别B(yǎng)技術(shù)的突破，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)模日趨擴(kuò)大，但是在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，仍然存在生長速度減慢、應(yīng)激性能差異大、大小規(guī)格分化嚴(yán)重和良種匱乏等問題，嚴(yán)重制約了長江刀鱭產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。因此，亟需培育生長快、抗逆性強(qiáng)的新品系以促進(jìn)刀鱭養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)又稱為生長分化因子-8(growth and differentiation factor 8，GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的重要成員，能夠通過抑制生肌決定因子家族成員的轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)控肌肉細(xì)胞的生長發(fā)育[3-4]。MSTN基因最初由McPherron等[5]從小鼠的骨骼肌細(xì)胞中分離獲得，并被鑒定為肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。后續(xù)的研究證實(shí)，敲除MSTN基因的小鼠肌肉質(zhì)量是正常野生型小鼠的2～3倍[6]，且缺失突變純合體的小鼠產(chǎn)生了類似于比利時(shí)藍(lán)牛(Belgian Blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等家畜品種的雙肌表型[3-4]。在水產(chǎn)動(dòng)物研究領(lǐng)域，基于基因編輯技術(shù)或RNAi技術(shù)抑制水產(chǎn)動(dòng)物MSTN基因的功能，亦能夠?qū)е虑圜?Oryziaslatipes)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[9]等試驗(yàn)魚類的肌肉明顯發(fā)達(dá)于正常魚，證實(shí)了MSTN基因能夠負(fù)調(diào)控魚類肌肉的生長和發(fā)育，在魚類良種選育方面具有重要研究價(jià)值。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A、T、C或G)的突變而引起的多態(tài)性，具有數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、二等位性及易于自動(dòng)化檢測等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物標(biāo)記輔助選擇、QTL定位和動(dòng)植物遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究中[10-11]，具有巨大的潛力和應(yīng)用前景。在水產(chǎn)動(dòng)物育種過程中，基于生長相關(guān)候選基因的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，篩選出與生長性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)，有助于在繁育親本的早期培育過程中進(jìn)行有效地篩選，從而提高選育效率，縮短良種培育進(jìn)程。目前，SNP分型的方法主要有直接測序法、TaqMan探針法、PCR-LDR分型技術(shù)、PCR-RFLP法、飛行質(zhì)譜檢測法和SNaPshot分型技術(shù)等。其中，SNaPshot基因分型方法，又被稱為小測序，主要是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理而獲得樣本精準(zhǔn)基因型的中通量SNP分型技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于大口黑鱸(Micropterussalmoides)[12]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[13]及尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[14]等水產(chǎn)動(dòng)物SNP位點(diǎn)的檢測和分型研究?；贛STN基因在遺傳育種上的潛在應(yīng)用價(jià)值，從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物研究領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道，以及其被作為重要經(jīng)濟(jì)物種遺傳改良重要候選基因[3]的研究背景，本研究將MSTN基因作為刀鱭生長性狀遺傳改良的重要候選基因，對其進(jìn)行多態(tài)性檢測與分型，并將基因多態(tài)性與刀鱭的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在篩選出能夠應(yīng)用于長江刀鱭生長性狀遺傳改良的分子遺傳標(biāo)記，為培育種質(zhì)優(yōu)良的刀鱭新品系提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刀鱭來自上海市水產(chǎn)研究所(上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站)奉賢科研基地。于2017年基于群體選育方法獲得繁育子代，同塘養(yǎng)殖2年后，隨機(jī)選取100尾刀鱭，用游標(biāo)卡尺和電子天平測得其平均體長為(21.89±4.51)cm、平均體高為(3.40±0.74)cm、平均體質(zhì)量為(39.83±22.73)g。剪取部分樣品尾鰭分別編號并置于裝有95%乙醇的2 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

每個(gè)試驗(yàn)樣品取25 mg左右，經(jīng)滅菌ddH2O清洗后，剪碎置于1.5 mL離心管。參照天根生化科技(北京)有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)的說明書，提取不同刀鱭樣品的基因組DNA。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue Plus紫外可見分光光度計(jì)的檢測結(jié)果評估樣本DNA的質(zhì)量和濃度。取凝膠電泳檢測顯示條帶清晰、無拖尾降解現(xiàn)象、且OD260 nm與OD280 nm的比值在1.8～2.0的DNA樣品，將其稀釋到50 ng/μL后，保存于-20 ℃冰柜中備用。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性SNP位點(diǎn)的篩選

根據(jù)刀鱭MSTN基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5對PCR引物(見表1)。其中Ce-MSTN-FL1和Ce-MSTN-FL2是參照大西洋鯡MSTN基因內(nèi)含子和外顯子的相對位置設(shè)計(jì)而成，用于擴(kuò)增刀鱭MSTN基因的第1內(nèi)含子和第2內(nèi)含子序列；Ce-MSTN-SC1、Ce-MSTN-SC2和Ce-MSTN-SC3則以刀鱭MSTN基因組DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)而成。然后，以具有極端生長表型的20尾刀鱭[即體質(zhì)量最大的10尾魚(89.53±14.51 g)和最小的10尾魚(18.75±1.62 g)]的DNA樣本為模板，利用直接測序法篩選刀鱭MSTN基因組DNA上的多態(tài)性位點(diǎn)。

1.4 PCR擴(kuò)增、測序和SNP分型

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 μL，包括2 μL的基因組DNA(50 ng/μL)、25 μL 2×Taq PCR MasterMix[1.25 UTaq聚合酶、500 μmol dNTP、20 mmol Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol KCl和3 mmol MgCl2]、2 μL的正引物(10 pmol/μL)、2 μL反向引物(10 pmol/μL)，最后用ddH2O補(bǔ)充總體積至50 μL。采用Eppendorf Mastercycler X50s PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，50～65 ℃(基于梯度PCR所獲得的引物最適退火溫度)退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。20尾刀鱭樣品的測序結(jié)果利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對，并結(jié)合測序峰值圖篩選潛在的SNP位點(diǎn)?；赟NP位點(diǎn)篩選結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性的PCR擴(kuò)增引物(見表1)，委托上海捷瑞生物工程有限公司利用SNaPshot基因分型技術(shù)對100尾2齡刀鱭進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測和分型。

表1 刀鱭MSTN基因全長擴(kuò)增及SNPs位點(diǎn)的篩選和檢測引物

1.5 SNP位點(diǎn)與性狀的相關(guān)性分析

利用GenAlEx 6.5軟件[15]計(jì)算刀鱭養(yǎng)殖群體的有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，NE)、觀測雜合度(observed heterozygosity，HO)、期望雜合度(expected heterozygosity，HE)等遺傳參數(shù)，并對分析SNP位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗(yàn)。利用PIC_CALC軟件計(jì)算試驗(yàn)群體中每個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)。利用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型(general linear model，GLM)分析每個(gè)SNP位點(diǎn)的不同基因型與刀鱭生長性狀(體質(zhì)量、體高和體長)之間的關(guān)聯(lián)程度。差異顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果

2.1 刀鱭MSTN基因擴(kuò)增和SNP位點(diǎn)的篩選

刀鱭MSTN基因全長3 278 bp，由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，其中第1、2內(nèi)含子分別由578和454個(gè)堿基組成，均符合GT-AG原則；第1、2和3外顯子由456、368和1 422個(gè)堿基組成(見圖1)。經(jīng)SNP位點(diǎn)篩選，僅在第1內(nèi)含子上篩選到3個(gè)SNP位點(diǎn)(g.564G>T,g.755G>T 和 g.786C>T)，它們在刀鱭MSTN基因上的位置如圖1所示。基于突變位點(diǎn)測序峰值圖能夠有效進(jìn)行等位基因的純雜合分型，在本研究中，峰值圖為單峰的均為對應(yīng)基因型的純合子(G/G、T/T和C/C)，而峰值圖為套峰的則代表該位點(diǎn)為雜合子(G/T、G/T和C/T)(見圖2)。

2.2 不同SNP位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

刀鱭MSTN基因上的3個(gè)SNP位點(diǎn)共9種基因型分別與刀鱭的生長性狀(體質(zhì)量、體長和體高)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。可以看出，位點(diǎn)g.564G>T的3種基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長和體高的比較結(jié)果一致，均是GT>GG>TT，其中3種基因型個(gè)體的體質(zhì)量和體長沒有顯著差異(P>0.05)，僅TT基因型個(gè)體的體高顯著小于GT型個(gè)體(P<0.05)。位點(diǎn)g.755G>T的3種基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長和體高的比較結(jié)果一致，均是GT>TT>GG，其中3種基因型的個(gè)體的體質(zhì)量和體長沒有顯著差異(P>0.05)，僅GG基因型個(gè)體的體高顯著小于GT型個(gè)體(P<0.05)。位點(diǎn)g.786C>T的3種基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長和體高的比較結(jié)果一致，均是CC>CT>TT，其中CC型個(gè)體的體質(zhì)量、體長和體高與CT型個(gè)體沒有顯著差異(P>0.05)，TT型個(gè)體的體質(zhì)量、體長和體高與CC型和CT型個(gè)體的差異顯著(P<0.05)。

表2 刀鱭MSTN基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)與生長性狀的相關(guān)性分析

2.3 SNP位點(diǎn)的群體遺傳分析

刀鱭MSTN基因上的3個(gè)SNP位點(diǎn)在刀鱭養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性參數(shù)見表3。有效等位基因數(shù)(NE)為1.497～1.835，觀測雜合度(HO)和期望雜合度(HE)分別為0.280～0.480和0.332～0.455，多態(tài)信息含量(PIC)為0.277～0.351，3個(gè)SNP位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)(0.250.05)。

表3 刀鱭MSTN基因上3個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)分析

本研究所篩選到的3個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率見表4。從中可以看出，GT基因型在位點(diǎn)g.564G>T和g.755G>T中占據(jù)優(yōu)勢地位，而CC基因型在位點(diǎn)g.786C>T中占據(jù)優(yōu)勢地位；等位基因G、T和C分別為3個(gè)SNP位點(diǎn)的優(yōu)勢基因。結(jié)合3個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型的生長數(shù)據(jù)可以看出，具有優(yōu)勢基因型和基因的個(gè)體，其生長性狀亦優(yōu)于其他基因型和基因的個(gè)體。

表4 3個(gè)SNP突變位點(diǎn)在刀鱭養(yǎng)殖群體中的基因型和等位基因頻率

3 討論

MSTN作為抑制動(dòng)物成肌細(xì)胞活化、增殖和分化的強(qiáng)化效應(yīng)因子，其基因在不同物種間高度保守，在某些條件下部分位點(diǎn)發(fā)生突變或缺失能夠?qū)е乱种苿?dòng)物肌肉細(xì)胞生長的功能減弱，因其基因多態(tài)性往往與動(dòng)物的生長、發(fā)育顯著相關(guān)，而在動(dòng)物性狀遺傳改良方面具有重要的應(yīng)用研究價(jià)值[16]。MTSN基因多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析最初在牛、豬、雞等禽畜類動(dòng)物中研究較多，證實(shí)該基因的部分突變位點(diǎn)與不同的經(jīng)濟(jì)性狀存在顯著的相關(guān)性，能夠應(yīng)用于相關(guān)動(dòng)物的分子標(biāo)記輔助良種選育研究[11]。

在水產(chǎn)動(dòng)物的研究方面，近年來，部分學(xué)者已在黃顙魚(Pelteobagrusefulvidraco)[17]、大口黑鱸(M.salmoides)[12]、草魚(C.idella)[18]、吉富羅非魚[119]、金頭鯛(Sparusaurata)[20]及中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]等重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物上開展MSTN基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究，以期能夠?yàn)橄嚓P(guān)水產(chǎn)動(dòng)物良種的分子選育奠定理論參考與支持。本研究利用直接測序法在養(yǎng)殖刀鱭MSTN基因的第1內(nèi)含子部分成功鑒定到了3個(gè)SNP位點(diǎn)(g.564G>T,g.755G>T 和 g.786C>T)，其中前兩個(gè)突變屬于顛換突變，位點(diǎn)g.564G>T中的GG、GT和TT基因型刀鱭個(gè)體分別與位點(diǎn)g.755G>T中的TT、GT和GG基因型個(gè)體相同，表明這兩個(gè)突變位點(diǎn)是連鎖的，且GT基因型個(gè)體的體高性狀分別顯著優(yōu)于TT和GG型個(gè)體(P<0.05)。位點(diǎn)g.786C>T為轉(zhuǎn)換突變，其TT基因型刀鱭的體長、體高和體質(zhì)量性狀均顯著低于其它兩種基因型(P<0.05)，CC基因型刀鱭的生長性狀亦優(yōu)于CT基因型，表明T等位基因的突變對于養(yǎng)殖刀鱭的生長性狀具有不利影響。此外，本研究僅在養(yǎng)殖刀鱭MSTN基因的第1內(nèi)含子部分檢測到突變位點(diǎn)，而在其他內(nèi)含子和外顯子部分暫未檢測到突變位點(diǎn)，表明養(yǎng)殖刀鱭的MSTN基因序列相對保守，內(nèi)含子由于不參與氨基酸的編碼，相對于外顯子，其受到的選擇壓力亦較小，因而更易于發(fā)生位點(diǎn)突變。

大部分學(xué)者亦在其他水產(chǎn)動(dòng)物MSTN基因的內(nèi)含子部分檢測到了與生長性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，與本研究的結(jié)果相一致。朱媛媛等[17]在黃顙魚(P.fulvidraco)MSTN基因的第1內(nèi)含子上鑒定到1個(gè)能夠應(yīng)用于雌性黃顙魚生長性狀改良的突變位點(diǎn)；俞菊華等[21]在建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)MSTN基因的第1內(nèi)含子上篩選到1個(gè)與體型密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)(T196G)；Wang Ying等[22]在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)MSTN基因第2內(nèi)含子上鑒定到1個(gè)與體質(zhì)量、體長和體高性狀顯著相關(guān)的SNP突變位點(diǎn)(C1197T)，其CC基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長和體高顯著低于另外兩種基因型的；唐永凱等[19]在吉富羅非魚MSTN基因第2內(nèi)含子的728 bp處發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與體型(體厚/體長、體高/體長)存在顯著相關(guān)(P< 0.05)的SNP突變位點(diǎn)(G/T)；張世勇等[23]在斑點(diǎn)叉尾魚回(Ictaluruspunctatus)MSTN基因的第2內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與體質(zhì)量和體長呈顯著性負(fù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)(g.4355 G>C)，其GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量和體長顯著低于另外兩種基因型的。與這些研究結(jié)果不同的是，Sun等[24]在鯉魚(C.carpioL.)MSTN基因的第3外顯子上檢測到2個(gè)與體質(zhì)量和肥滿度顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。以上研究證實(shí)，不同的試驗(yàn)對象，由于其所受到的選擇壓力及生存環(huán)境不同，因而產(chǎn)生了不同程度的遺傳突變，導(dǎo)致同一基因上的SNP位點(diǎn)具有一定的物種差異性。雖然不同水產(chǎn)動(dòng)物MSTN基因突變位點(diǎn)的位置和特性有所差異，但是均與相應(yīng)水產(chǎn)動(dòng)物的生長性狀存在不同程度的相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)有望應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物生長性狀的遺傳改良。

本研究利用直接測序法和SNaPshot基因分型技術(shù)，成功鑒定到了1個(gè)與養(yǎng)殖刀鱭的體長、體高和體質(zhì)量性狀顯著相關(guān)的分子標(biāo)記(g.786C>T)，該標(biāo)記有望作為剔除劣質(zhì)刀鱭繁育親本的候選分子標(biāo)記?？紤]到魚類的生長性狀受多種基因的調(diào)控，后續(xù)將繼續(xù)篩選更多與長江刀鱭生長性狀顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，用以制訂更加科學(xué)、有效的長江刀鱭分子標(biāo)記輔助育種策略。