魏俏紅 韓賓 吳帆 張旭鳳 孟麗峰 段香媛 馮毛 胡菡

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2 中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院浙江省生物計(jì)量及檢疫檢驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）園藝研究所，太原 030031）

蜜蜂（Apoidea）是一種社會(huì)性昆蟲，也是少數(shù)人工馴化的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一。一個(gè)正常蜂群由一只能生育的雌性蜂王、大量不育的雌性工蜂和一定數(shù)量的雄蜂組成，種群的生存和發(fā)展依賴于個(gè)體間的勞動(dòng)分工和相互協(xié)作，所以群體內(nèi)的信息交流十分復(fù)雜[1]。隨著人們對(duì)蜜蜂行為特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)和研究不斷深入，蜜蜂逐漸成為研究神經(jīng)生物學(xué)、社會(huì)行為學(xué)、群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域的新興模式生物[2]。

作為模式生物，蜜蜂具備其他一些模式生物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。第一，蜜蜂腦相對(duì)簡單。腦是蜜蜂主要的感覺中心，是調(diào)控行為和生理活動(dòng)的中樞，能夠接受和處理來自眼和觸角的神經(jīng)刺激并形成相應(yīng)指令。蜜蜂腦體積較小，大約只有100 萬個(gè)神經(jīng)元[3]，僅僅是人類大腦的十萬分之一[4]。盡管蜜蜂的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性有限，但其神經(jīng)元間的信息交流機(jī)制幾乎與脊椎動(dòng)物相同[5]。而與模式生物果蠅相比，蜜蜂腦雖然只有果蠅腦的4 倍，但行為卻比獨(dú)居的果蠅復(fù)雜的多，所以蜜蜂更適合用于神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究[4]。第二，個(gè)體遺傳背景可以控制。在蜜蜂育種和科研中，蜂王人工授精技術(shù)已十分成熟[6]，研究人員容易獲得遺傳性狀穩(wěn)定可控的個(gè)體，使得科學(xué)研究可以持續(xù)進(jìn)行。第三，對(duì)蜜蜂感官、導(dǎo)航和通訊等相關(guān)的行為學(xué)研究已經(jīng)有了長足的發(fā)展[7]，獲得了很多有用的行為學(xué)知識(shí)，這有利于深入研究神經(jīng)信號(hào)與行為的關(guān)系。第四，生活史短，且易于飼養(yǎng)。蜜蜂工蜂從卵發(fā)育到成蟲只需21 天，且蜂王每日產(chǎn)卵近千枚，科研人員可以獲得大量實(shí)驗(yàn)樣本[8]。因此，蜜蜂作為模式生物，特別是作為研究神經(jīng)生物學(xué)的模式生物具有重要意義。

對(duì)于腦科學(xué)實(shí)驗(yàn)，全腦解剖是研究的第一步。蜜蜂腦較小，整個(gè)頭部更是不足1mm3，總量小于1mg，且蜜蜂腦柔軟，外周被幾丁質(zhì)外殼包裹[9]，完整解剖難度較大，相關(guān)的解剖技術(shù)發(fā)展緩慢且報(bào)道很少。Guy Bloch 等報(bào)道在干冰下進(jìn)行解剖，但沒有給出詳細(xì)步驟[10]。Norman L Carreck 等和趙元洪等盡管介紹了蜜蜂腦解刨方法，但沒有涉及腦部亞區(qū)以及腦部腺體的分離[11,12]，而蜜蜂腦由前腦、中腦和后腦三部分組成。前腦包括蘑菇體和中央復(fù)合體等高級(jí)中樞，控制學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)；中腦包含觸角葉，是嗅覺神經(jīng)中心，接受和傳遞各種信息素和外界氣味物質(zhì)的信號(hào)；而后腦通常不發(fā)達(dá)，主要包括內(nèi)分泌神經(jīng)元和控制進(jìn)食與消化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[13-15]，所以解剖分離各個(gè)腦區(qū)和腦部腺體對(duì)準(zhǔn)確收集樣品，進(jìn)而深入研究不同腦區(qū)和腺體的功能至關(guān)重要。

因此，在前人的基礎(chǔ)上，我們希望通過改進(jìn)解剖方法，探索更加快速而完善的技術(shù)，一方面使解剖速度加快，減少樣品核酸和蛋白等成分的降解以保證樣品的有效性，另一方面一次性分離保證蜜蜂腦各組織和分區(qū)的腺體更加完整，這項(xiàng)技術(shù)將為蜜蜂或其他昆蟲腦科學(xué)研究提供幫助。本實(shí)驗(yàn)將此項(xiàng)解剖技術(shù)應(yīng)用于出房蜂、哺育蜂和采集蜂工蜂腦、腦亞區(qū)和腦部腺體的取樣，分析不同發(fā)育期蜜蜂腦區(qū)的形態(tài)差異。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

體式顯微鏡1 臺(tái)（上海締倫光學(xué)儀器有限公司；締倫XTL-206A 三目連續(xù)變倍體視顯微鏡）、蠟盤1個(gè)（將熔化的蜂蠟過濾后倒入培養(yǎng)皿）、尖頭鑷子2把（中鏡科儀：型號(hào)5-SA）、普通載玻片、100 微升移液器（Thermo Finnpipette；F3）、昆蟲針2 根、蛋白酶/RNA 酶抑制劑PBS 溶液。

1.2 取樣

本實(shí)驗(yàn)所用蜜蜂均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院8 號(hào)樓樓頂蜂場。所取樣品分3 個(gè)日齡，分別為出房蜂、哺育蜂、采集蜂。從蜂箱中取出一張即將出房的子脾放到培養(yǎng)箱（溫度34℃，濕度70%～85%）過夜，第二天抓取出房<24h 的蜜蜂作為出房蜂；哺育蜂是將剛出房的蜜蜂用油漆筆標(biāo)記，待10日齡抓?。徊杉涫窃诜湎淇谧ト『笞銛y帶花粉的蜜蜂。將新取回的蜜蜂用CO2麻醉；鑷子、載玻片、顯微鏡用酒精擦拭消毒；然后在載玻片上滴加20 微升蛋白酶/RNA 酶抑制劑溶液，放置在冰盒中備用。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂腦解剖

取新鮮蜜蜂或CO2麻醉后，首先把蜜蜂正面放在蠟盤上，用兩根昆蟲針傾斜穿過胸部將蜜蜂固定在蠟盤上（圖1）。

解剖過程主要分三個(gè)步驟：（1）劃開腦部幾丁質(zhì)：用左手鑷子夾住蜜蜂腦部，使其固定不動(dòng)（圖2），用右手鑷子在蜜蜂腦部外圍復(fù)眼處扎一小孔（圖3），然后在小孔處沿著外圍將幾丁質(zhì)劃開（圖4）；（2）去除上部幾丁質(zhì)：左手鑷子夾住喙幾丁質(zhì)邊緣，右手鑷子夾住劃開處幾丁質(zhì)外殼（圖5），向上掀起腦部上方幾丁質(zhì)，并挑起觸角處的幾丁質(zhì)（圖6）；（3）取出腦部：掀掉上部幾丁質(zhì)后，腦部組織完全暴露出來（圖7），右手鑷子水平從蜜蜂腦后下方插入托起腦部組織（圖8），使整個(gè)腦部組織完全位于鑷子上方，再用鑷子輕輕抬起，即可得到完整的腦組織，將獲得的腦組織轉(zhuǎn)移到載玻片上，放入準(zhǔn)備好的抑制劑溶液中，預(yù)備進(jìn)行下一步腺體和腦亞區(qū)的分離。

圖1 固定蜜蜂（15X）

圖2 左手鑷子夾住頭部（15X）

圖3 右手鑷子在復(fù)眼上部扎一小孔（20X）

圖4 從小孔處向左右劃開幾丁質(zhì)（15X）

圖5 揭起腦殼上部（20X）

圖6 掀掉腦殼（15X）

圖7 揭去腦殼后（20X）

圖8 取出大腦（20X）

1.3.2 蜜蜂腦亞區(qū)分離

將已經(jīng)取出的腦部組織放在滴有蛋白酶/RNA 酶抑制劑溶液的載玻片上（圖9），首先一次性分離左、右兩側(cè)復(fù)眼，避免復(fù)眼破裂內(nèi)容物流出使其他區(qū)域染上顏色；再剝離覆蓋于腦部外層的白色膜；將兩側(cè)的視網(wǎng)膜分離，即可將兩側(cè)的視神經(jīng)葉取出（圖10A）；去掉上側(cè)單眼處物質(zhì)，即可得到蘑菇體（圖10B），嗅神經(jīng)葉位于磨菇體下部，去掉磨菇體后剩余部分即為嗅神經(jīng)葉，去掉周圍少量的其他組織，就可得到完整干凈的嗅神經(jīng)葉（圖10C）。

圖9 完整的蜜蜂大腦（20X）

圖10 蜜蜂腦模擬圖（A 視神經(jīng)葉，B 磨菇體，C 觸角神經(jīng)葉）

圖10 蜜蜂腦分區(qū)（A 視神經(jīng)葉，B 蘑菇體，C 觸角神經(jīng)葉）（20X）

圖11 取出上顎腺（20X）

1.3.3 上顎腺、咽下腺和唾液腺的分離

上顎腺（Mandibular gland）位于腦部內(nèi)上顎上面，是一對(duì)囊狀體，開口于上顎基部兩側(cè)。上顎懸掛于頭部口的兩端，緊接在上唇基部后面。上顎基部處有一凹窩為上顎腔，有前后兩個(gè)關(guān)節(jié)聯(lián)系點(diǎn)與頭部相連，并有兩條肌肉附著于活動(dòng)軸的兩對(duì)面，使得上顎能左右活動(dòng)。解剖時(shí)，掀掉蜜蜂腦部幾丁質(zhì)后，挑開連接在蜜蜂喙處上方的多余幾丁質(zhì)外殼，夾住頭部，再用鑷子夾住上顎腺體外的部位，輕輕拔出即可（圖11）。

咽下腺（Hypopharyneal glands）是位于蜜蜂頭部的一對(duì)外分泌腺體，覆蓋在蜜蜂腦上方（圖9），又稱舌腺、營養(yǎng)腺或蜂王漿腺。咽下腺共有兩條，每條腺體由一條長而呈葡萄狀的腺泡組成，腺泡產(chǎn)生白色或淡黃色的蛋白質(zhì)分泌物——蜂王漿。取咽下腺時(shí)，要先將復(fù)眼去掉，以免取出咽下腺時(shí)復(fù)眼破裂液體流出污染咽下腺和其他組織；用鑷子夾住咽下腺輕輕一拉便可拉出整條咽下腺，再將黏附于咽下腺的雜質(zhì)去掉，就可得到干凈的蜜蜂咽下腺組織（圖13）。

唾液腺（Salivary glands）共兩對(duì)，分別為頭唾腺和胸唾腺。頭唾腺位于蜜蜂頭部背側(cè)復(fù)眼底部左右各一串，通常與咽下腺纏繞在一起。頭唾腺的形態(tài)與咽下腺有明顯差別，解剖時(shí)只需在剝離咽下腺后，從中拉出唾液腺即可（圖14）。

2 結(jié)果

2.1 腦分區(qū)

蜜蜂視神經(jīng)葉（Optic lobe，OL）位于腦部兩側(cè)，體積相對(duì)較大，基本占蜜蜂腦體積一半以上，實(shí)驗(yàn)中最先分離。首先去除復(fù)眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，然后用鑷子直接剝離視神經(jīng)葉。

觸角神經(jīng)葉（Antennal lobe，AL）位于蜜蜂腦的正前方，類似于球狀結(jié)構(gòu)，是連接蜜蜂觸角的區(qū)域，也是蜜蜂的初級(jí)嗅覺中樞，主要接收來自觸角的氣味信息，再將信息傳遞給蘑菇體[16]。由于觸角神經(jīng)葉較小，容易丟失，解剖過程中必須保證腦部組織的完整取出才能獲得該部分。

蜜蜂的蘑菇體（Mushroom body，MB）約占大腦總體積的19%，共含有約36800 個(gè)神經(jīng)元，占大腦神經(jīng)元的40%，是蜜蜂的高級(jí)中樞[17]。蘑菇體呈杯狀結(jié)構(gòu)，又分成幾個(gè)部分，解剖時(shí)要保證其完整性。

2.2 上鄂腺

對(duì)出房蜂、哺育蜂和采集蜂上顎腺比較發(fā)現(xiàn)，出房蜂上顎腺體呈透明狀，腺體內(nèi)容物較少；哺育蜂上顎腺腺體飽滿呈淡黃色，內(nèi)容物多；采集蜂上顎腺腺體也呈黃色，干癟且內(nèi)容物少（圖12）。

圖12 蜜蜂不同日齡上顎腺（A 出房蜂，B 哺育蜂，C 采集蜂）（20X）

2.3 咽下腺

不同日齡工蜂的咽下腺發(fā)育程度不同，剛出房的工蜂咽下腺發(fā)育不完全，腺體較小，腺泡透明，顏色呈白色（圖13A）；哺育蜂咽下腺腺泡飽滿、圓潤，顏色呈淡黃色（圖13B）；采集蜂咽下腺腺泡較小，內(nèi)容物少，外觀較干癟，顏色呈深黃色（圖13C）。

圖13 蜜蜂不同日齡咽下腺（20X）

2.4 唾液腺

出房蜂唾液腺與上顎腺、咽下腺發(fā)育階段形態(tài)一致都較干癟，內(nèi)容物少，腺泡呈透明狀；哺育蜂唾液腺形態(tài)與出房蜂相比變化不顯著；而采集蜂唾液腺腺泡內(nèi)容物增多，顏色呈淡黃色（圖14）。

圖14 蜜蜂不同日齡唾液腺（20X）

3 討論

3.1 影響蜜蜂解剖效率的因素

高效完整的蜜蜂解剖為更加精準(zhǔn)的研究提供了重要的基礎(chǔ)。對(duì)于大部分昆蟲來說，它們體積小，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，解剖更是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)的任務(wù)。蜜蜂頭部不足1mm3，總量小于1mg，切下解剖并不容易操作。在此，我們通過改進(jìn)方法，探索出了更加簡單和完整的解剖技術(shù)。

精準(zhǔn)的解剖步驟決定樣品質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將蜜蜂使用CO2麻醉，麻醉后放置到冰盒中以防止蜜蜂蘇醒。在解剖過程中固定蜜蜂也很重要，固定蜜蜂應(yīng)該選用兩根昆蟲針從蜜蜂胸部兩側(cè)傾斜插入，這樣的固定不影響后續(xù)的解剖[18]。實(shí)驗(yàn)中好的解剖工具能夠達(dá)到事半功倍的效果，尤其是劃幾丁質(zhì)用的鑷子，尖銳且較硬質(zhì)的鑷子較為順手，容易劃開幾丁質(zhì)，解刨用時(shí)最短樣品質(zhì)量越好。同時(shí)，經(jīng)過長期冷凍或在室溫久置的蜜蜂不易解刨；鮮活的未經(jīng)過冷凍處理的蜜蜂，解剖蜂腦會(huì)更加容易，組織更加完全。在解剖蜂腦的過程中，應(yīng)注意不要?jiǎng)澠茝?fù)眼，因?yàn)閺?fù)眼內(nèi)物質(zhì)色深且易流出污染其他組織；正常操作時(shí)，鑷子會(huì)觸碰到幾丁質(zhì)，將頭部絨毛和雜物帶入，為避免污染，應(yīng)及時(shí)用酒精棉擦拭干凈。

3.2 不同日齡蜜蜂腦部組織存在區(qū)別

作為社會(huì)性昆蟲，不同日齡的蜜蜂功能不同，所以發(fā)育階段不同的蜜蜂腦在形態(tài)學(xué)上必然存在差異。為此，我們對(duì)工蜂出房蜂、哺育蜂和采集蜂腦部組織進(jìn)行了多方面比較。從外部看，出房蜂、哺育蜂和采集蜂腦部大小沒有明顯差異。但是，解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)它們的幾丁質(zhì)外殼硬度不同。幾丁質(zhì)也稱殼多糖（chitin），為N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖，主要是用來作為支撐身體的骨架，以及對(duì)身體起保護(hù)的作用[19]。出房蜂腦幾丁質(zhì)外殼較軟，而哺育蜂和采集蜂幾丁質(zhì)堅(jiān)硬，說明隨著發(fā)育，蜜蜂腦殼逐漸變硬。幾丁質(zhì)外殼成分和結(jié)構(gòu)隨著日齡變化，這在蜜蜂寄生蟲狄斯瓦螨中已有報(bào)道，即螨類在發(fā)育不同階段利用不同的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白。但這種機(jī)制在蜜蜂中還沒有相關(guān)研究。

剖開腦殼從內(nèi)部看，工蜂出房蜂、哺育蜂和采集蜂腦內(nèi)部組織狀態(tài)也不同。整體來說，出房蜂腦內(nèi)部體積較小，組織不飽滿，顏色呈乳白色；哺育蜂腦內(nèi)部腺體發(fā)達(dá)，各部位飽滿，顏色呈淡黃色，腦部組織與咽下腺相比較??；采集蜂腦內(nèi)部開始萎縮，腺體干癟，咽下腺腺體呈深黃色。相比于采集蜂，出房蜂和哺育蜂腦內(nèi)水分含量較高。

其次對(duì)蜜蜂腦各個(gè)亞區(qū)進(jìn)行比較。蜜蜂腦亞區(qū)主要包括蘑菇體、視神經(jīng)葉和觸角神經(jīng)葉三部分，蘑菇體是蜜蜂的高級(jí)中樞[17]。接收和處理來自外界的所有刺激，視神經(jīng)葉和觸角神經(jīng)葉的信號(hào)最終都要經(jīng)過蘑菇體處理，然后反饋或形成穩(wěn)固的記憶。視神經(jīng)葉主要接收和處理來自復(fù)眼的光信號(hào)，觸角神經(jīng)葉是蜜蜂的初級(jí)嗅覺中樞，主要接收來自觸角的氣味信息。三者功能明顯不同，所以成功分離各個(gè)亞區(qū)對(duì)于深入研究局部功能有著重要作用，如：對(duì)中華蜜蜂和意大利蜜蜂上述三個(gè)亞區(qū)蛋白質(zhì)組比較發(fā)現(xiàn)，蘑菇體中蛋白質(zhì)主要對(duì)突觸的塑造和長期記憶的形成具有重要作用，視神經(jīng)葉上核糖核酸作為第二信使在視覺傳導(dǎo)中起重要作用，而兩者觸角神經(jīng)葉的蛋白質(zhì)功能的顯著差異才是決定中華蜜蜂嗅覺更加靈敏的原因[20]。但是蜜蜂腦各個(gè)亞區(qū)體積太小，在體視鏡下沒有觀察到三個(gè)時(shí)期蜜蜂蘑菇體、視神經(jīng)葉和觸角神經(jīng)葉等亞器官有何差異，需要進(jìn)一步通過生物學(xué)方法進(jìn)行分析。

3.3 蜜蜂腺體的形態(tài)與其功能和日齡直接相關(guān)

上顎腺是蜜蜂重要的外分泌腺體，其分泌物是維系蜂群社會(huì)性結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)。雖然工蜂和蜂王的上顎腺結(jié)構(gòu)相似，但其分泌物的組成和功能差別極大[21]。蜂王上顎腺主要參與蜂王信息素的合成，包括9-ODA、順-9-HDA、反9-HDA 以及10-HDA等物質(zhì)，它們在蜂群發(fā)展和群內(nèi)調(diào)控中發(fā)揮極其重要的作用。工蜂上顎腺分泌物的信息素類功能并不突出，而在蜂群營養(yǎng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如在哺育蜂時(shí)期參與蜂王漿的合成[20]，因而腺體飽滿充滿內(nèi)容物。

不同日齡蜜蜂咽下腺的形態(tài)不同，這與蜜蜂勞工分配密切相關(guān)。咽下腺是分泌蜂王漿的主要器官，這是哺育蜂的主要職能[22]。哺育蜂的主要任務(wù)是飼喂幼蟲，它們的咽下腺十分發(fā)達(dá)，即使都是哺育蜂，哺育能力強(qiáng)的工蜂咽下腺也比哺育能力弱的哺育蜂腺體發(fā)達(dá)[23]。6～12日齡的工蜂，其咽下腺發(fā)育基本成熟，分泌活動(dòng)最強(qiáng)，是分泌王漿高峰期[24]。隨著工蜂日齡的增加，到達(dá)采集蜂時(shí)期，其咽下腺逐漸萎縮退化，咽下腺已經(jīng)失去分泌蜂王漿的能力[25]。但是，工蜂咽下腺的發(fā)育卻是可逆的，或者說工蜂咽下腺發(fā)育不受日齡的限制[26]。研究表明，蜂群中缺少哺育蜂時(shí)，采集蜂會(huì)逆轉(zhuǎn)為哺育蜂并飼喂幼蟲，三天后其咽下腺活性增強(qiáng)[27]；而在無幼蟲的蜂群中，哺育蜂的咽下腺雖然正常發(fā)育，其生理功能與越冬蜂群相似[28]。咽下腺發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制需要深入研究，所以完整解剖對(duì)后續(xù)研究具有重要意義。

蜜蜂頭部唾液腺在不同日齡時(shí)期的形態(tài)變化與咽下腺和上顎腺卻不完全一樣，這與唾液腺的腺體功能和蜜蜂的社會(huì)勞動(dòng)分工密切相關(guān)。唾液腺在采集蜂時(shí)期形態(tài)飽滿，腺體發(fā)育成熟，這是由于蜜蜂在采集蜂時(shí)期外出采集花粉、花蜜，唾液腺需要分泌大量的唾液進(jìn)入花粉和花蜜。唾液中的轉(zhuǎn)化酶將花蜜主要的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖[29]。

4 結(jié)論

本研究改進(jìn)了蜜蜂腦部組織解剖的操作方法，一次性獲得多個(gè)組織如：咽下腺、上顎腺、蘑菇體、視神經(jīng)葉、嗅神經(jīng)葉等，提高了解剖效率，也降低了實(shí)驗(yàn)樣本的需求，為不同的研究工作提供優(yōu)質(zhì)的組織樣品。本方法使用的解剖工具簡單，只需要兩把尖頭鑷子就可完成整個(gè)操作步驟?？s短了操作時(shí)間，還有效保證了組織樣品中信息的完整，這也為蜜蜂的后續(xù)研究提供了有力的技術(shù)支撐。同時(shí)，初步比較了不同日齡工蜂主要腺體和腦亞區(qū)差異，這對(duì)進(jìn)一步研究蜜蜂腦有一定幫助。