王雅慧，彭祚登，李 云

（1.北京林業(yè)大學 林學院，省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2.北京林業(yè)大學 生物與技術學院，北京 100083）

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是土壤中生理生化反應的重要參與者。作為土壤養(yǎng)分重要的源和匯[1]，對土壤物質周轉起到重要的作用，并對土壤環(huán)境變化和養(yǎng)分有效性有很強的響應[2-3]。由于微生物個體微小，需要分子生物學方法克服傳統(tǒng)觀察法的局限，磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）生物標記法被Frostegard[4]應用到土壤微生物分析后，開始被廣泛用于土壤微生物群落結構的檢測。土壤酶主要來源于土壤微生物、根系分泌及動植物殘體釋放[5]，催化土壤中的生化反應，其活性可以反映土壤中生物化學反應的強度，是物質循環(huán)中最活躍的生物活性物質[6]。土壤可溶性碳、氮源自土壤微生物的生命活動和有機物的溶解[7]，是微生物生長和生物分解過程中的重要能量來源，在森林土壤碳氮循環(huán)等養(yǎng)分循環(huán)中起到重要作用[8-9]。因此，本研究中的土壤生物學特性以土壤微生物群落結構、酶活性、可溶性有機碳和有機氮為特征指標。

河南省洛寧縣在20 世紀60～70年代開始刺槐Robinia pseudoacacia種植，引種于朝鮮，造林40 余萬畝，面積占當?shù)赜貌牧置娣e的60%以上[10]。作為該縣的主要造林樹種，在出產木材、水土保持等方面發(fā)揮了巨大的作用，又經(jīng)過多次砍伐萌蘗更新，形成了不同世代及林齡的林分，為不同世代刺槐林土壤變化的研究提供了較為理想的對象，同時對豫西黃土類型區(qū)土壤條件的了解有一定的參考性。

目前刺槐對土壤作用的研究主要可分為橫向和縱向兩大類。按時間梯度上刺槐對土壤性質作用的縱向研究包括隨刺槐生長年限的變化，土壤酶活性[11]、化學計量學[12]、養(yǎng)分的變化[13]、生態(tài)修復作用[14]，小的時間尺度上的季節(jié)動態(tài)變化[15]等。隨刺槐林齡的增加土壤微生物量、酶活性等土壤生物學特性得到改善的結論相對較多，而關于刺槐林世代經(jīng)營過程中對土壤生物學特性影響的研究相對匱乏，多代刺槐林地與地力的關系如何還是個未知數(shù)，因此本研究選取相同林齡（地上部分）不同世代的林分，從土壤生物學特性的角度分析刺槐人工林多代經(jīng)營中土壤性質的變化，為土壤地力維持機制及調控提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于河南省西部的洛寧縣國有呂村林場（111°15′～111°35′E、34°20′～34°32′N），地處崤山南部淺山區(qū)，海拔約700 m，是黃土高原的邊緣地帶。屬大陸季風性氣候，年均溫13.9℃，年均降水量568 mm，年日照約2 006 h。土壤類型為幼褐土，母質為黃土。試驗區(qū)內主要灌木為荊條Vitex negundovar.heterophylla、酸棗Ziziphus jujubavar.spinosa、野薔薇Rosa multiflora，主要開花草本有蒲公英Taraxacum mongolicum、翅果菊Lactuca indica、黃花蒿Artemisia annua、夏至草Lagipsis supina等。

1 代刺槐人工林為實生苗造林形成的林分，2代林為1 代林皆伐后萌蘗形成，2 代林皆伐后萌蘗更新形成3 代林。輪伐期為15～20 a，對照地為灌木草地。

1.2 土壤樣品采集方法

在2018年4月結合當?shù)卦炝钟涗泴嵉乜疾旌?，確定選擇同世代的刺槐人工林樣地以及對應的鄉(xiāng)土植被作為對照樣地。選取了東偏北的半陰坡、上坡位，人為干擾較弱的位置較為接近、立地條件一致的4 種樣地，各樣地基本情況見表1。在每代林分樣地及對照樣地中分別設置3 個20 m×20 m的樣方。于2018年10月上旬在每個樣方選定兩株平均標準木，具有該樣地的生長環(huán)境代表性，于其側挖掘剖面，按前期土壤剖面調查，參考《LY/T1958—2011 森林可持續(xù)狀況評價導則》從上到下分為枯落物層A、腐殖質層B（也稱為淋溶層，到深20 cm 左右）、淀積層C（＞90 cm），因此實際取樣深度分別對應去掉表層枯落物后的0～5 cm，10～20 cm，40～60 cm，60～80 cm（本文中表示為A、B、C1、C2）的土壤約1 kg（避開20～40 cm 存在的過渡層），一份冷凍保存用于微生物的測定，一份風干處理用于測定酶活性等。

表1 樣地基本信息?Table 1 General situation of sites

1.3 測定方法

土壤微生物群落結構采用磷脂脂肪酸（PLFA）法，凍土稱量8 g，軟件：MIDI Sherlock Microbial Identification System 6.0 (Microbial ID,Inc.125 Sandy Drive.Newark,DE 19713.)；色譜：安捷倫6850N；檢測器：FID；進樣量2 μL；內標19∶0。脲酶測定用苯酚鈉次氯酸鈉顯色法，活性以37℃下培養(yǎng)24 h 后每克土壤產生的銨態(tài)氮的質量（mg）表示。蔗糖酶活性測定用3,5-二硝基水楊酸比色法，以37℃培養(yǎng)24 h 后每克土壤產生的葡萄糖的質量（mg）表示。中性磷酸酶測定用磷酸苯二鈉比色法，活性以37℃下培養(yǎng)24 h 后每克土壤中酚的質量（mg）表示。多酚氧化酶測定用鄰苯三酚顯色法，以30℃培養(yǎng)2 h 后每克土壤中紫色沒食子素的毫克數(shù)表示（mg）?？扇苄杂袡C碳氮采用總有機碳分析儀測定[7]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，單因素方差分析顯著性（P＜0.05），多重比較采用LSD 和Tukey 檢驗法（各組樣本量不相等和相等時）[16]，方差不齊時采用Cruskal-Wallis 秩和檢驗，Excel 2010制圖。利用Canoco 4.5進行主成分分析并作圖。

建立隸屬度函數(shù)，參考翟輝等[17]的方法，用因子在各土層的平均值進行計算，因本文中各指標的作用均為正向，所以確定隸屬度值的公式采用：

式中：Qi表示各因子的隸屬度值，Xij表示實際值，Ximin和Ximax分別表示i項中的最小值和最大值。

各活性因子的作用大小權重Wi：

式中：Li為第i個因子的的因子負荷量。

土壤生物學活性指數(shù)（Soil biological activity index，SAI）：

土壤微生物多樣性指數(shù)（H）參考文獻[18]：

式中：Pi是樣品中某一特征PLFA 的含量在總PLFA 量中的比值，S是樣品中所有特征PLFA 的總數(shù)。

2 結果與分析

2.1 多世代刺槐林的經(jīng)營對土壤微生物群落的影響

不同樣地土壤樣品中共鑒定出46 種特征PLFA，細菌（a11:0、a12:0、i13:0、a13:0、i14:0、a14:0、i15:0、a15:0、i16:0、a16:0、i17:0、a17:0、i18:0、i19:0、10:0 3OH、12:0、13:0、14:0、15:0、i16:0、16:1w9c、16:1w7c、16:1w5c、16:0、cy17:0w7c、17:0、18:1w7c、18:1w5c、18:0、cy19:0w9c、cy19:0w7c、20:4w6c、20:0、22:0），放線菌（10Me16:0、10Me17:1w7c、10Me 17:0、10Me18:1w7c、10Me18:0、10Me19:1 w7c、10Me20:0），真菌（18:3 w6c、18:2w6c、18:1w9c、20:5w3c、20:1w9c），來表征微生物種類[19-26]。

4 個土層取樣中各特征類群含量變化范圍如圖1，各微生物類群含量隨土壤深度增加而降低（二代林地的A 層表現(xiàn)異常），上層土壤數(shù)值較大，下層土壤數(shù)值小。表征細菌的PLFA 含量在刺槐林世代經(jīng)營過程中表現(xiàn)為二、三代林地＞一代林地＞對照地，最大值出現(xiàn)在二代林地B 層，為23.12 nmol·g-1，最小值出現(xiàn)在對照地的C2 層，為1.85 nmol·g-1。放線菌的特征PLFA 含量的變化趨勢為二代林地＞三代林地＞一代林地、對照地，最大值出現(xiàn)在三代林地A 層，4.74 nmol·g-1，最小值出現(xiàn)在對照地的C2 層，0.33 nmol·g-1。真菌的特征PLFA 含量在各樣地間的差異幅度小于其他菌群，與放線菌、細菌的變化趨勢不太一致，最大值出現(xiàn)在一代林地A 層，2.62 nmol·g-1，最小值出現(xiàn)在對照地的C2 層，0.27 nmol·g-1。PLFA 生物標記的多樣性代表著微生物群落的多樣性，土壤微生物群落PLFA 生物標記的多樣性指數(shù)結果顯示，二、三代林地的表土層多樣性指數(shù)稍高于對照地和一代林地，在深土層高于對照地和一代林地且差異較大，三代林地比對照地、一代林地在C2 土層的微生物多樣性指數(shù)分別高30.77%、34.53%。

圖1 各林地土壤特征微生物類群PLFA 量及微生物多樣性指數(shù)在各樣地土層的分布Fig.1 Content of soil soluble organic carbon and nitrogen in different generations of Robinia pseudoacacia

2.2 不同世代刺槐林土壤酶活性的比較

由表2可知，脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶三種酶活性的垂直差異比較明顯，表層土酶活性高于深層土，多酚氧化酶則變化不大。在不同世代刺槐林地間土壤酶活性存在差異（P＜0.05），總體隨世代增加是上升的，表層變幅大于深層。

在A 土層，三代林地的脲酶和蔗糖酶活性最強（P＜0.05），脲酶活性相比于一、二代林、對照地分別高180.95%、202.56%、187.80%，在一、二代林、對照地間差異不顯著，蔗糖酶則分別高37.32%、18.72%、7.67%。二代林地中性磷酸酶和多酚氧化酶活性最強，但中性磷酸酶在各樣地間差異不顯著（P＞0.05）。土深B 處，除脲酶在三代林地活性最強外，蔗糖酶、中性磷酸酶和多酚氧化酶均在二代林地出現(xiàn)最高值。土深C1 處，各樣地間脲酶無顯著性差異，蔗糖酶活性在二、三代林地顯著高于一代林地和對照地（P＜0.05），中性磷酸酶活性表現(xiàn)為一二帶林地高于三代林地、對照地，多酚氧化酶是二代林＞三代林＞對照＞一代林地，土深C2 處，脲酶和多酚氧化酶在各樣地間均間差異不顯著（P＞0.05），蔗糖酶活性表現(xiàn)為三代林＞二代林＞一代林＞對照地，中性磷酸酶在樣地間差異很小，有林地間差異不顯著（P＞0.05），對照地相對較低。

2.3 各樣地土壤微生物群落與酶性質組成特征差異

對4 個樣地的46 種微生物磷脂脂肪酸含量及4 種酶活性綜合進行主成分分析，可以從整體看1、2、3 代刺槐林與CK 對照樣地中土壤基本生物學性質是否有差異。如圖2所示，第一主成分（PC1）解釋了微生物群落結構總變異的93.2%，第二主成分（PC2）解釋了5.9%。A 層和B 層土壤的各樣地及對照地明顯可以區(qū)分開來，而土層越深，本試驗中的C1、C2 層，樣地間差異較小，各樣地間區(qū)分不明顯。

表2 各土層不同樣地的土壤酶活性?Table 2 Soil enzyme activity in different soil layers of different sites mg·g-1

圖2 各樣地土層土壤微生物PLFA 與酶活性綜合主成分分析Fig.2 Principal component analysis of microbial group’s PLFA and enzyme activity in in different soil layers of different sites

2.4 不同世代刺槐林土壤可溶性有機碳氮的比較

本試驗種土壤可溶性有機碳量含量范圍為11.41～26.67 mg·kg-1，由圖3a 可以看出，在B、C1、C2 層各樣地間差異不顯著，在A 層二代林地高于一、三帶林地，顯著高于對照地（P＜0.05）。在表土層中，二代林＞三代林、一代林＞對照地。

土壤可溶性有機氮含量范圍為4.34～6.52 mg·kg-1（圖3b）。同一土層均表現(xiàn)出二、三代林地略高于一代機林地、對照地的趨勢?？傮w上可溶性有機碳氮含量由高到低分別為二代林、三代林、一代林、對照地。

圖3 不同世代刺槐林土壤可溶性有機碳、氮含量Fig.3 Content of soil soluble organic carbon and nitrogen in different generations of Robinia pseudoacacia

2.5 土壤生物學活性指數(shù)

選取的7 個指標的第一主成分貢獻率為60.25%，第二主成分貢獻率為24.44%，兩主成分可以代表原變量的信息，因此可用各指標的因子負荷量確定權重，可溶性有機碳、可溶性有機氮、脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶、多酚氧化酶、總PLFA量的權重分別為0.075、0.177、0.157、0.183、0.116、0.140、0.153，經(jīng)計算得一代刺槐林地、二代刺槐林地、三代刺槐林地、對照地的土壤生物學活性指數(shù)（SAI）分別為0.22、0.77、0.75、0.09。即各樣地土壤生物學特性綜合比較結果從大到小依次為二代林地、三代林地、一代林地、對照地，二、三代林地差值非常小。

表3 土壤生物學活性因子隸屬度值Table 3 Membership function value of soil biological activity factor

3 討 論

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，兩個主成分足以把各樣地的土壤微生物群落和酶區(qū)分開，說明在種植刺槐林后，當?shù)氐耐寥郎镄再|發(fā)生了明顯的變化。同時，淺層土和深層土區(qū)分度的差異可以說明原始微生物群落組成相近，而刺槐種植年限的影響及根系、枯落物的作用顯著影響了淺層土性質的變化。

細菌、真菌、放線菌是構成土壤微生物的主要生物種群。隨著刺槐世代的增加，土壤微生物量總體呈增加趨勢，與以往的研究結果中林齡是造成這種差異主要因素相似[24,27]，都是時間梯度上變化。在有林地中，隨著刺槐種植時間的增加，植物生長、生物量積累，林下的物質積累也較大。刺槐林內環(huán)境在一代林中處于開始發(fā)展階段，經(jīng)歷了整地造林，二、三代林林下植被恢復，且更新過程中沒有重新整地，為土壤微生物提供更多的生存條件，可能因此有著較高的微生物多樣性。有林地與對照地相比，微生物總量高于對照地，可能跟刺槐是固氮樹種有關，固氮樹種提高了氮的可利用性[28]，生產力較高，可為更多的微生物提供基礎代謝物質。真菌在養(yǎng)分較低的條件下更具有競爭力[29]，甚至高含氮量的土壤真菌菌落生物量會減少。此外，有研究發(fā)現(xiàn)真菌群落的減少有利于復雜有機復合物在土壤中的積累[30]，所以這可能是研究中真菌群落與其他微生物類群分布差異較大的原因。

可表征土壤生物活性的土壤酶[31]的活性高低與土壤肥力高低有關。脲酶是參與土壤氮轉換的關鍵酶，可把有機氮轉化為有效態(tài)氮[32]。蔗糖酶參與土壤有機碳的循環(huán)，其活性反映了有機碳的轉化速率及土壤呼吸強度，因而可表征微生物活性和土壤肥力[5]。本研究試驗地pH值在7.06～7.14之間，所以所測磷酸酶為中性磷酸酶，磷酸酶影響著土壤中有機磷的生物有效性，因此這三種酶可以反映土壤碳氮磷養(yǎng)分的供應狀況。土壤多酚氧化酶在芳香族有機化合物轉化為腐殖質的過程中起作用。楊承棟等[33]的研究表明多酚氧化酶活性與真菌多樣性呈極顯著正相關，與本文中多酚氧化酶在同樣地各土層間的變化量較小，而真菌也相較于其他類群在土層間的變化量較小這兩個結果相一致。土壤酶活性與土壤養(yǎng)分，植被類型，立地環(huán)境等條件有關，本研究中二、三代林地土壤酶活性整體均高于一代林和對照地，反映了其養(yǎng)分狀況較好（與本課題的試驗結果一致）及較強的微生物活性。上層土壤通氣性好，養(yǎng)分含量高，微生物更活躍，因此土壤酶也表現(xiàn)出垂直性差異。

土壤可溶性碳和可溶性氮作為生物活性碳、氮，主要來自于植物根系、土壤腐殖質以及微生物分泌物等，是微生物生長和生物分解過程中的重要能量來源[34]，可被微生物直接利用[35]。本試驗中，同一土層可溶性氮含量均表現(xiàn)出二、三代林地高于一代林地、對照地的趨勢，總體上由高到低分別為二代林地、三代林地、一代林地、對照地。原因可能是刺槐及其林下植被給土壤可溶性有機氮提供了較多的來源，同時，與一代林地和對照地相比，二、三代林地的土壤微生物多樣性較高，可能是與氮轉換有關的微生物在刺槐林地中較為活躍。相較于可溶性有機氮，可溶性有機碳表現(xiàn)出相似的趨勢，但其在各樣地間的差異相對于可溶性有機氮而言較小。以表土層為例，本研究發(fā)現(xiàn)二、三代林地的可溶性有機碳、氮含量是高于一代林地的，但各樣地可溶性有機碳與土壤有機碳含量的比值從一代林低到對照地分別是0.37%，0.24%，0.2%，0.16%，可溶性有機氮與土壤全氮含量的比值從一代林地到對照地分別是0.83%，0.54%，0.60%，0.51%，二、三代林地反而較低，其原因可能是一代林地的有機碳和全氮的、含量低于二、三代林地，因此兩者比值較大。此外，可能是一代林地目前正在處于初始積累階段，更多的碳氮以活性較高的可溶性碳、氮存在，可看作是一種負反饋，一代林地的增長幅度高于二、三代林地。

本研究中未涉及不同齡級對土壤性質的影響，林木不同發(fā)育階段生理機能及組成是不一樣的，伴生動植物組成可能會有差別，同時未進一步確定各種環(huán)境因子與土壤微生物等生物特性因子的關系。在對刺槐土壤生物學特性的研究中，大型土壤動物，各種昆蟲和蚯蚓等，它們與土壤微生物共同作用于土壤，促進能量流動和養(yǎng)分周轉，與刺槐固氮作用相關的微生物等都需要進一步研究。

4 結 論

1）細菌、放線菌磷脂脂肪酸含量、微生物群落的多樣性指數(shù)在刺槐林各代經(jīng)營過程中整體表現(xiàn)為二、三代林地＞一代林地＞對照地。土壤微生物PLFA 的主成分分析結果表明，不同經(jīng)營世代導致四個樣地的微生物群落結構差異明顯，在刺槐種植及世代經(jīng)營過程中整體土壤微生物結構含量發(fā)生了變化。

2）脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶在表層土中活性高于深層土，多酚氧化酶垂直變化較小。在各代刺槐林地間土壤酶活性存在差異（P＜0.05），二、三代林地土壤酶活性整體均高于一代林和對照地，且表層增幅大于深層。

3）試驗地土壤可溶性有機碳量范圍為11.41～26.67 mg·kg-1，整體表現(xiàn)為二代林地＞一、三代林地＞對照地。土壤可溶性有機氮范圍為4.34～6.52 mg·kg-1，整體表現(xiàn)為為二、三代林地＞一代林地＞對照地。

4）一代刺槐林地、二代刺槐林地、三代刺槐林地、對照地的土壤生物學活性指數(shù)（SAI）分別為0.22、0.77、0.75、0.09，在豫西淺山黃土丘陵區(qū)種植刺槐能有效提升土壤生物學活性，多代經(jīng)營到第三代也保持著較高的水平。