何森 ， 謝東 ， 宋美玲 ， 潘濤 ,2， 董偉 ,2

(1.江西理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 江西 贛州341000; 2. 江西省礦冶環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 贛州341000)

0 引 言

稀土有著“工業(yè)維生素”“新材料之母”的稱號(hào)，已廣泛應(yīng)用于眾多高科技領(lǐng)域，對(duì)科技的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)[1-2]。 我國(guó)作為稀土大國(guó)，離子型稀土礦是我國(guó)特有的資源，早在20 世紀(jì)70 年代就已實(shí)施開(kāi)采[3]，但由于早期開(kāi)采工藝與設(shè)備的簡(jiǎn)單，造成了一系列的環(huán)境污染問(wèn)題[4]，如植被破壞、水土流失、微生物種類減少等[5]。 在我國(guó)素有“稀土王國(guó)”美譽(yù)的江西贛州，因稀土開(kāi)采導(dǎo)致18 個(gè)縣（市、區(qū)）出現(xiàn)不同生態(tài)受損問(wèn)題[1]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于稀土廢棄礦及尾礦的生態(tài)修復(fù)做了大量研究，主要修復(fù)方法有物理法、化學(xué)法、微生物法與植物法等。其中植物修復(fù)技術(shù)具有修復(fù)成本低，操作簡(jiǎn)單，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，在礦山修復(fù)中有著良好的應(yīng)用前景[6]。 Khan、徐芮等發(fā)現(xiàn)一些植物能夠蓄積稀土元素[7-8]，劉勝洪等則進(jìn)一步利用香根草紫花苜蓿、柱花草、馬唐草、蟣子草、山毛豆、木豆、翅莢決明、油桐等多種植物對(duì)稀土礦區(qū)進(jìn)行植物修復(fù)[9]，發(fā)現(xiàn)這些植物具有較高的耐脅迫能力，并且通過(guò)不同配置取得了很好的修復(fù)效果。然而隨著研究的深入，科研人員發(fā)現(xiàn)植物修復(fù)的大多數(shù)超累積植物具有生物量低、 植物難以回收等缺點(diǎn)，導(dǎo)致該技術(shù)無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用[10]。 因而研究人員將關(guān)注點(diǎn)聚焦于微生物與植物存在著的互利共生關(guān)系，以期提高植物的抗逆性， 利用植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)來(lái)解決植物修復(fù)土壤生態(tài)問(wèn)題[11-12]。

細(xì)菌不僅在維持土壤肥力與結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也會(huì)敏感地對(duì)細(xì)微的環(huán)境變化做出相應(yīng)的反應(yīng)，如土壤中積累的重金屬對(duì)細(xì)菌的生理生態(tài)產(chǎn)生影響，因此細(xì)菌被認(rèn)為是重要的土壤質(zhì)量研究的有效生物指標(biāo)[13]。 植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR）是指分布在植物根際周圍的一類能夠分泌有益物質(zhì)從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌[14-16]，在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的植物根際促生菌主要包括芽孢桿菌屬 （Bacillus spp.）、 假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、沙雷氏菌屬（Serratia spp.）、固氮 螺 菌 屬 （Azospirillum spp.）、 不 動(dòng) 桿 菌 屬（Acinetobacter spp.）、 無(wú) 色 菌 屬 （Achromobacter spp.）等[17-20]。 其中芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）是一類非致病的對(duì)機(jī)體無(wú)害的好氧細(xì)菌， 具有耐酸堿、耐高溫、耐擠壓、極高的環(huán)境兼容性和對(duì)重金屬有較好吸附性等特點(diǎn)[18-19]，在土壤修復(fù)上具有極高的應(yīng)用前景。

然而，針對(duì)離子型稀土礦山植物根際促生菌的研究較少。 前期報(bào)道主要集中對(duì)含鎘、鉛等重金屬污染土壤根際促生菌的篩選、鑒定及促生能力的研究[21-23]，例如Chen 等從重金屬污染土壤中篩選出了兩株植物促生菌J62 與Y-1-3-9[20]，它們都具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用和對(duì)Cd 的吸收作用。 因此，本研究以贛南離子型稀土廢棄礦區(qū)植物修復(fù)過(guò)的根際土壤為試驗(yàn)對(duì)象，從根際土壤中篩選具有根際促生能力的芽孢桿菌菌株，探索菌株的促生特性及其對(duì)稀土離子的耐受力。試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)有利于人們加深對(duì)贛南離子型稀土廢棄礦的植物修復(fù)作用的了解， 也進(jìn)一步為實(shí)施植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品取至我國(guó)江西省贛州市龍南稀土礦區(qū)（東經(jīng) 114.84°，北緯 24.83°）。 用鐵鏟將杉樹(shù)、濕地松、桉樹(shù)等植株根部周圍土壤去除，用毛刷將根上附著的土壤收集，置于冰盒中低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室置于零下80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

主要試劑：L-色氨酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鉻天青S（上海麥克林生化科技有限公司）；Nessler’s 試劑（上海麥克林生化科技有限公司）；硝酸銩（上海九鼎化學(xué)科技有限公司）；硝酸鋱（上海九鼎化學(xué)科技有限公司）。

菌株的初篩、 發(fā)酵培養(yǎng)和保存均利用Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基；采用 Salkowski 試劑測(cè)定菌株產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力[24]；利用無(wú)鐵（KMB）培養(yǎng)基檢測(cè)菌株產(chǎn)鐵載體能力[25]；利用 Nessler’s 試劑測(cè)定 NH3的產(chǎn)生能力[24]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根際芽孢桿菌的初篩

使用分析天平準(zhǔn)確稱取根際土壤10 g，加入帶有玻璃珠和90 mL 無(wú)菌水的250 mL 三角瓶中， 將其放入搖床150 rpm 振蕩10 min，后靜置10 min。 取其上清液1 mL 于EP 管內(nèi)，置于80 ℃水浴10 min，后放入冰塊中迅速冷卻至室溫，吸取100 μL 上清液涂布到LB 固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）中過(guò)夜培養(yǎng)。 挑取單菌落于LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)3 次，并分別編號(hào)，用濃度為30%的無(wú)菌甘油于-28 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株促生性質(zhì)的研究

1）產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力的測(cè)定：將待測(cè)菌株接種到含有0.5 g/L 色氨酸的LB 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min）36 h，后取 50 μL 培養(yǎng)懸浮液到白瓷板中， 加入100 μL 顯色試劑 （4.5 g/L FeCl3，10.8 mol/L H2SO4），室溫下避光放置 30 min，觀察顏色變化，顏色變紅則表示有IAA 產(chǎn)生。 將培養(yǎng)液在8000 rpm 下離心5 min，取2 mL 上清液，加入4 mL 顯色試劑，著色30 min 后，用分光光度法測(cè)定550 nm 處的光密度，可對(duì)IAA 的產(chǎn)生能力進(jìn)行定量測(cè)定。

2）產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定：將待測(cè)菌株接種到帶無(wú)鐵（KMB）培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng) 24 h（37 ℃，150 r/min），然后 8000 rpm 離心 5 min 取上清液，按 1∶1 的比例將該上清液與CAS 檢測(cè)液混合， 若顏色由藍(lán)色變成橘紅色則有鐵載體的產(chǎn)生。 以富鐵培養(yǎng)基為對(duì)照，用分光光度法測(cè)定630 nm 處的光密度，可測(cè)定產(chǎn)鐵載體的數(shù)量。

3）產(chǎn)NH3能力的測(cè)定：將菌株轉(zhuǎn)接到含10 mL蛋白胨水培養(yǎng)基的(10g/L)試管中，搖床培養(yǎng)72 h（37 ℃，150 r/min）， 每管加入 0.5 mL 的 Nessler’s試劑，顏色由褐色轉(zhuǎn)為黃色的表明有NH3產(chǎn)生。

1.2.3 菌株的鑒定

將篩選到的菌株中促生能力較強(qiáng)的菌株用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 離心收集菌體，并提取細(xì)菌的基因組DNA， 采用通用引物 (正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’； 反向引物：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） 擴(kuò)增其細(xì)菌基因組DNA 中16S rRNA 基因片段。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，將所測(cè)序列輸入到NCBI 上進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比， 利用MEGA5.1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以確定菌株的種類。

1.2.4 芽孢桿菌對(duì)稀土離子銩、鋱的耐受性分析

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的具有較強(qiáng)促生能力的芽孢桿菌菌液，取50 μL 接種到含有不同濃度（等濃度梯度）硝酸銩與硝酸鋱的LB 培養(yǎng)基中。 以未接種的LB 液體培養(yǎng)基為對(duì)照， 在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定0～12 h 菌株的生長(zhǎng)曲線，利用SPSS 22.0 計(jì)算出半抑制濃度（IC50）。

以上各項(xiàng)定性和定量檢測(cè)均進(jìn)行兩次獨(dú)立試驗(yàn)，每次獨(dú)立試驗(yàn)均設(shè)置了3 個(gè)重復(fù)。 以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行處理， 采用SPSS 22.0 進(jìn)行IC50的統(tǒng)計(jì)分析。

2 研究結(jié)果

2.1 根際芽孢桿菌的初篩結(jié)果

離子型稀土礦區(qū)植物根際土壤經(jīng)過(guò)80 ℃水浴處理后，水樣經(jīng)稀釋涂布法在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，根據(jù)菌株不同的形態(tài)特征，從贛州市龍南稀土礦區(qū)根際土壤初步分離篩選到了31 株芽孢桿菌菌株。

2.2 初篩菌株的促生特性

微生物菌株分泌吲哚乙酸（IAA），能夠促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)和根際分泌物的產(chǎn)生， 從而提高植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[26-27]。 本試驗(yàn)利用Salkowski 法對(duì)上述31 株芽孢桿菌產(chǎn)IAA 的能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示，篩選出的14 株芽孢桿菌具有產(chǎn)IAA 能力，IAA 產(chǎn)量的范圍為3.65～36.63 mg/L， 其中菌株 P3-3、Y16-2、Y18-3 所產(chǎn) IAA的活性較高，分別達(dá)到 36.63，30.08，34.74 mg/L。

圖1 具有產(chǎn)IAA 能力的芽孢桿菌產(chǎn)IAA 量

鐵載體的產(chǎn)生不僅能與土壤中的Fe、Cu、Zn、Cd 等重金屬離子結(jié)合，使重金屬離子活化，并且能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)[3]。 固氮細(xì)菌能將空氣的N2轉(zhuǎn)化為 NH3，也具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[26]。 因此， 本試驗(yàn)對(duì)具有產(chǎn)IAA 能力的芽孢桿菌進(jìn)行了產(chǎn)鐵載體與產(chǎn)NH3的定性測(cè)定。 結(jié)果見(jiàn)表1，具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株有5 株，具有產(chǎn)NH3能力的菌株有14 株， 而同時(shí)具有產(chǎn)鐵載體和氨氣的有5 株，分別為 P3-1、SP1-3、Y17-2、Y18-2、Y18-3， 而菌株Y17-1 不具有產(chǎn)鐵載體能力， 也不具有產(chǎn)NH3能力。理論上，所篩菌株能在實(shí)際植物修復(fù)中產(chǎn)生一定的作用， 應(yīng)具有多項(xiàng)促生特性， 其中菌株Y18-3不僅具有較高的產(chǎn)IAA 活性， 又可固氮和產(chǎn)生鐵載體，具有較強(qiáng)的促生特性，因此可作為目標(biāo)菌種進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3 菌株的基因序列鑒定結(jié)果

將所篩選的5 株具有多項(xiàng)促生特性的菌株P(guān)3-1、SP1-3、Y17-2、Y18-2、Y18-3 基于 16S rRNA基因測(cè)序分析，將所得擴(kuò)增序列與NBCI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較，初步鑒定該5 種菌株菌屬。 結(jié)果如圖2 所示，該5 種菌株均屬于芽孢桿菌：菌株P(guān)3-1與Y17-2 屬于蠟樣芽孢桿菌，SP1-3 屬于假蕈狀芽孢桿菌，菌株Y18-2 屬于解木糖賴氨酸芽孢桿菌，Y18-3 屬于紡錘形賴氨酸芽孢桿菌。

表1 產(chǎn)IAA 芽孢桿菌其他促生特性

圖2 篩選的5 株菌株16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 菌株Y18-3 對(duì)稀土離子銩、鋱的耐受性

菌株Y18-3 在不同濃度下稀土離子的生長(zhǎng)曲線如圖3 和圖4 所示， 高濃度稀土離子銩、鋱對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定的抑制作用， 而且隨著銩、鋱離子濃度的增加，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間越晚。 從圖3 可看出，稀土離子超過(guò)一定濃度后菌株不再生長(zhǎng)， 當(dāng)銩離子濃度達(dá)到3.24 mmol/L時(shí)，菌株將無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)。 稀土離子銩、鋱對(duì)菌株Y18-3 造成半致死效應(yīng)后的濃度均超過(guò) 2 mmol/L，分別達(dá)到 2.22，2.29 mmol/L，說(shuō)明菌株Y18-3 對(duì)于三價(jià)稀土離子銩、鋱都具有極高的耐受性。

圖3 菌株Y18-3 對(duì)銩離子的耐受性

圖4 菌株Y18-3 對(duì)鋱離子的耐受性

3 討論與結(jié)論

植物根際促生菌 （PGPR） 的概念最早是Kloepper 等提出的[26]，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注，PGPR 不僅能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)， 還會(huì)影響對(duì)土壤重金屬的吸收，改善土壤的生態(tài)環(huán)境[27-29]。 PGPR是通過(guò)分泌生長(zhǎng)素、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn) NH3、溶磷、解鉀等機(jī)制直接或間接的促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[30-31]，目前PGPR 的篩選大多以此為依據(jù)， 如王小兵等從江蘇沿海灘涂分離得到了具有顯著促生作用的細(xì)菌[32]，測(cè)定了產(chǎn)ACC 脫氨酶、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體的能力。冀玉良以溶磷、解鉀為篩選指標(biāo)[31]，從商州區(qū)油菜根際土壤中分離得到了19 株P(guān)GPR， 后續(xù)測(cè)定了產(chǎn)NH3、產(chǎn)IAA 和固氮能力，其中K-25 的促生能力最強(qiáng)。 李想等測(cè)定了5 項(xiàng)促生指標(biāo)， 包括產(chǎn)NH3、產(chǎn)HCN、產(chǎn)鐵載體、溶磷能力、解鉀能力[33]，對(duì)初篩得到的20 株菌株進(jìn)行再次培養(yǎng)篩選，結(jié)果表明B2-4、B3-1、LX4、LX5、B3-6、LX7、LY-1 為 植 物 根 際促生菌。

本研究從贛南離子型稀土礦篩選得到了31 株菌株，通過(guò)對(duì)產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體與產(chǎn)NH3能力的檢測(cè)鑒定后，成功分離并得到了具有顯著促生作用的菌株Y18-3。 經(jīng)16S rRNA 基因序列分析結(jié)果表明，菌株Y18-3 屬于紡錘形賴氨酸芽孢桿菌。 前期研究表明，芽孢桿菌作為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌種，能通過(guò)產(chǎn)芽孢的方式在各種惡劣環(huán)境下存活[21]，本研究從離子型稀土礦區(qū)植物根際篩選得到的具有較強(qiáng)促生能力的菌株大多為芽孢桿菌，這一發(fā)現(xiàn)也與之前的研究結(jié)果類似。 例如，謝越盛等從植物根際篩選了838 株菌株[34]，通過(guò)對(duì)其促生能力進(jìn)行賦值評(píng)價(jià)，指紋圖譜分析以及溫室實(shí)驗(yàn)， 探究出具有較好促生能力的菌株為JC01，經(jīng)16S rRNA 基因鑒定為枯草芽孢桿菌；張義等利用保綠法和蘿卜子葉增重法從芡實(shí)根際土壤中分離出2 株有較好效果的菌株Q6-2、Q67[35]，經(jīng)鑒定均為地衣芽孢桿菌。

細(xì)菌通過(guò)排除、調(diào)節(jié)、生物轉(zhuǎn)化、甲基化與去甲基化等方式，從而表現(xiàn)出對(duì)重金屬的耐受性[36]，并且通過(guò)產(chǎn)生一定的酸性物質(zhì)（如乙酸）來(lái)提高重金屬的溶解度，提高重金屬離子的可利用性，通過(guò)去除、螯合和固定作用除去金屬的毒素[37]。 一般來(lái)說(shuō)，為了評(píng)估所分離得野生菌株在實(shí)際生物修復(fù)中的有用性，則需要檢測(cè)其重金屬的耐受性。 如黃軍等從高濃度重金屬污染土壤中分離純化出1 株具有較強(qiáng)鎘耐受性的菌株LY29-1-5[38]，該菌株表現(xiàn)耐受鎘離子的最高濃度為15 mmol/L，同時(shí)也對(duì)低抑制濃度的鉛、銅、鋅表現(xiàn)出了一定的耐受性。向君亮等從狗尾草根際土壤中共分離得到兩株具有固定重金屬和促生能力的菌株N3 和H12[39]，并通過(guò)搖瓶吸附試驗(yàn)和小麥種植培養(yǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證了這兩株菌株對(duì)小麥生長(zhǎng)的促進(jìn)作用， 以及對(duì)吸收Cd 和Pb的阻礙作用。 本研究中同樣檢測(cè)了菌株Y18-3 對(duì)銩的耐受性半致死濃度為2.22 mmol/L， 對(duì)鋱的耐受性半致死濃度為2.29 mmol/L， 菌株對(duì)銩和鋱離子的耐受性都極高， 因此可見(jiàn)Y18-3 是對(duì)稀土離子具有抗性的芽孢桿菌菌株。

該研究主要得到以下結(jié)論： ①?gòu)慕魇≮M州市龍南離子型稀土礦區(qū)土壤中篩選得到31 株芽孢桿菌， 其中能分泌 IAA 的有 14 株， IAA 產(chǎn)量最高的菌株是 P3-3、Y16-2、Y18-3，分別達(dá)到 36.63，30.08，34.74 mg/L； 同時(shí)具有產(chǎn)鐵載體和 NH3能力的菌株有 5 株，分別為 P3-1、SP1-3、Y17-2、Y18-2、Y18-3；②菌株 Y18-3 具有高產(chǎn) IAA、產(chǎn)鐵載體和NH3等較強(qiáng)的促生特性，同時(shí)對(duì)銩與鋱等稀土離子有較高的耐受性，半致死濃度均大于2 mmol/L，經(jīng)16S rRNA 基因序列分析鑒定為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌； ③該依據(jù)所篩選并鑒定出的根際促生芽孢桿菌菌株具有潛在的促生及土壤修復(fù)作用，但尚未驗(yàn)證其實(shí)際對(duì)植物的促生作用與土壤的修復(fù)效果， 可通過(guò)進(jìn)一步的盆栽實(shí)驗(yàn)或大田實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述，本研究結(jié)果為促進(jìn)贛南稀土礦區(qū)植物根際促生菌的開(kāi)發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步利用根際促生菌改善土壤生態(tài)環(huán)境，助力贛南離子型稀土廢棄礦植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)與可行方法。