浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

近年來，隨著發(fā)病率的不斷上升，肺癌已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，其中非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是肺癌常見的病理類型，約占肺癌發(fā)生率的85%[2]。近十年來，雖然NSCLC的診斷與治療已經(jīng)取得明顯進展[3]，但晚期患者預(yù)后仍不佳，轉(zhuǎn)移成為NSCLC患者治療失敗及死亡的主要原因。

中醫(yī)認為腫瘤轉(zhuǎn)移者，多是癌毒稽留而不去，同時攻伐太過，導(dǎo)致機體抗邪能力下降[4]，正氣虧虛，免疫功能低下，免疫細胞難以殺滅循環(huán)腫瘤細胞[5]，以致腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、擴散。因此，正氣虧虛是腫瘤轉(zhuǎn)移的根本原因[6]。肺癌是一種全身屬虛、局部屬實的病證。晚期NSCLC患者虛癥尤為明顯，其中脾虛證是最常見證型，嚴重影響著患者的預(yù)后[7]。“培土生金”法通過補脾土生肺金，可明顯提高患者的生存質(zhì)量，延長生存期[8]。臨床上，眾多醫(yī)家將培土生金法用于肺癌轉(zhuǎn)移的防治，取得了較滿意的效果[9-12]。黃土湯方源于《金匱要略》，其主要功效為溫陽健脾、養(yǎng)血止血，臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，以黃土湯為基礎(chǔ)方治療NSCLC轉(zhuǎn)移具有一定的療效，尤其對于咳血的患者作用更佳。本研究擬通過體外實驗，進一步驗證黃土湯抑制NSCLC轉(zhuǎn)移的作用，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞 人NSCLC細胞株P(guān)C9、A549、H125、H647均由浙江省人民醫(yī)院惠贈。

1.2 實驗動物 無特定病原體（specified pathogen free，SPF）級雄性SD大鼠5只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2013-0184]。

1.3 藥物 黃土湯由甘草12g、干地黃60g、白術(shù)40g、炮附子40g、阿膠48g、黃芩48g、赤石脂240g組成，以上藥物均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供。

1.4 試劑 杜爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購于杭州賽洛進生物科技有限公司（批號：8120130）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于上海生工生物工程股份有限公司 （批號：F815FA0001）；三抗購于源葉生物公司（批號：S20F10G81214）；胰蛋白酶購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號：1911150405）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4 DNA Ligase均購于日本TaKaRa公司 （批號：RR086B、AA4502-1、AHE4572A、06114KA1）；放射免疫沉淀試驗（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購于上海基爾頓生物科技有限公司（批號：BYL40836）；四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-Tetramethylethylenediamine，TEMED）購于美國Amresco公司 （批號：00761）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購于賽國生物科技有限責(zé)任公司（批號：EZ2811F153）；端錨聚合酶2（tankyrase 2，TNKS2）、β-肌動蛋白（beta-actin，β-actin）、腺瘤樣息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）一抗購于Abcam公司（批號：ab92329、ab8227、ab32197）；IRDye 800羊抗兔二抗和IRDye680羊抗鼠二抗購于Licor公司（批號：926-32211、926-68070）。

1.5 儀器 BX51型數(shù)碼生物顯微鏡購于日本Olympus公司；Varioskan Flash多功能酶標儀為美國賽默飛公司產(chǎn)品；Mini－PROTEAN Tetra電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot Electrophoretic槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和qPCR儀均購于美國Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)購于美國Licor公司；5541R高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司。

1.6 方法

1.6.1 細胞培養(yǎng) H125、H647、A549、PC9均采用含10% FBS的DMEM，于37℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6.2 qPCR檢測TNKS2表達 收集對數(shù)生長期的4種細胞，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，1個循環(huán)；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；95℃ 10s，65℃ 60s，97℃ 1s，1個循環(huán)。采用公式2-ΔΔct計算基因相對表達量。所有引物由杭州有康生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6.3 TNKS2小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾/過表達慢病毒構(gòu)建包裝及轉(zhuǎn)染 基于美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站檢索獲得TNKS2全基因序列，合成TNKS2序列并設(shè)計短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）靶點序列，構(gòu)建TNKS2干擾過表達慢病毒，設(shè)計和構(gòu)建由賽瀾生物技術(shù)（杭州）有限公司完成。將上述病毒感染對應(yīng)細胞，獲得穩(wěn)定的NSCLC細胞株，再分別提取細胞內(nèi)總RNA、總蛋白，鑒定干擾過表達效果。

1.6.4 含藥血清制備 將所有藥材以蒸餾水800mL浸泡30min，煎煮1h，將兩次煎煮所得的藥液混合濃縮，最終濃度為7.8g·mL-1[13]，即大鼠灌胃濃度。按照臨床上成人等效劑量帶入換算公式，計算出大鼠每日最大中藥煎劑灌胃量為10.9g/（kg·d），以該劑量灌胃1周。末次灌胃1h后眼眶取血，室溫靜置4h，3 000r/min離心15min后分離血清，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌，56℃水浴滅活30min，-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5 劃痕實驗 將細胞分為8組：A549+FBS組、A549+黃土湯含藥血清組、A549 TNKS2+FBS組、A549 TNKS2+黃土湯含藥血清組、H647+FBS組、H647+黃土湯含藥血清組、H647 siRNA+FBS組、H647 siRNA+黃土湯含藥血清組，其中A549+FBS組和H647+FBS組分別與1.6.1細胞培養(yǎng)中的A549和H647細胞相同處理。先用含10% FBS的完全培養(yǎng)基進行鋪板，將各組細胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)6h后待細胞貼壁，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，分別于6孔板內(nèi)進行劃痕，PBS清洗2次，去除脫落細胞，再分別加入含黃土湯含藥血清以及含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，最后在0、24h時鏡下觀察并拍照。細胞遷移能力以細胞遷移率表示，細胞遷移率 （%）=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。

1.6.6 Western blot法檢測TNKS2蛋白和APC蛋白表達變化 將H647和A549細胞分為4組：黃土湯含藥血清+H647 siRNA干擾組、H647 siRNA干擾組、黃土湯含藥血清+A549過表達組、A549過表達組，其中H647 siRNA干擾組、A549過表達組以FBS培養(yǎng)，黃土湯含藥血清+H647 siRNA干擾組、黃土湯含藥血清+A549過表達組中加入黃土湯含藥血清。各組培養(yǎng)48h后收獲細胞并提取總蛋白，蛋白定量后電泳并轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉90min，分別加入一抗（TNKS2稀釋比例1:10 000、APC稀釋比例1:5 000），4℃孵育過夜，含Tween20的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween20，TBST）漂洗3次，加入IRDye800羊抗兔二抗（稀釋比例1:10 000）和IRDye680羊抗鼠二抗（稀釋比例1:10 000）避光孵育90min。吸去二抗并洗凈后以紅外激光成像系統(tǒng)掃描，以Primer 6.0軟件分析圖像。以β-actin為內(nèi)參，進行半定量檢測，計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.01軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析及獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞篩選 qPCR結(jié)果提示，H647細胞TNKS2基因表達明顯高于A549、H125、PC9細胞系（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），而A549、H125細胞系基因表達量較低，且兩種細胞間基因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1?；诿绹Ｊ脚囵B(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）的細胞背景調(diào)查發(fā)現(xiàn)，A549細胞系惡性程度低于H125，因此選擇H647為本底TNKS2基因高表達細胞系，A549為本底TNKS2低表達細胞系，用于后續(xù)實驗。

圖1 各組細胞TNKS2表達比較Fig.1 Comparison of TNKS2 expression in each group

2.2 干擾/過表達慢病毒構(gòu)建 通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫檢索，基于PCR擴增技術(shù)對TNKS2全基因序列進行擴增，通過慢病毒載體構(gòu)建pSLLV-CMV-TNKS2-puro質(zhì)粒。見圖2。通過TNKS2干擾靶點預(yù)測合成siRNA序列，構(gòu)建pSLLV-U6-si TNKS2-puro質(zhì)粒。見圖3。通過感染293T細胞獲得TNKS2基因過表達/干擾慢病毒，病毒滴度檢測如表2。

表2 病毒滴度值及獲取體積Tab.2 Virus titer value and acquisition volume

圖2 慢病毒載體pSLLV-CMV-puroFig.2 Lentiviral vector pSLLV-CMV-puro

圖3 慢病毒載體pSLLV-U6-puroFig.3 Lentiviral vector pSLLV-U6-puro

2.3 TNKS2過表達/干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞鑒定 以TNKS2干擾慢病毒轉(zhuǎn)染H647細胞，構(gòu)建TNKS2穩(wěn)定干擾的細胞株；以TNKS2過表達慢病毒轉(zhuǎn)染A549細胞，構(gòu)建TNKS2穩(wěn)定過表達的A549細胞株。提取細胞內(nèi)總RNA和總蛋白，分別通過qPCR和Western blot進行鑒定。鑒定提示，與H647細胞比較，經(jīng)siRNA-TNKS2干擾后H647細胞內(nèi)TNKS2基因和蛋白表達明顯降低（P＜0.001，P＜0.001），而且設(shè)定的2號siRNA干擾效果更佳。與A549細胞比較，經(jīng)TNKS2過表達干預(yù)后A549細胞內(nèi)TNKS2基因和蛋白表達明顯升高（P＜0.001，P＜0.001）。見圖4。

圖4 TNKS2過表達/干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞鑒定Fig.4 Identification of TNKS2 overexpression/interference stable transfection cell

2.4 細胞遷移能力變化檢測 黃土湯含藥血清干預(yù)24h后，與A549+FBS組比較A549+黃土湯含藥血清組細胞遷移率顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)過TNKS2基因過表達干預(yù)后，A549 TNKS2+FBS組細胞遷移率有所上升（P＜0.05），經(jīng)過TNKS2基因過表達和黃土湯含藥血清聯(lián)合干預(yù)后，細胞遷移率與A549 TNKS2+FBS組比較明顯降低（P＜0.05）。見圖5。黃土湯含藥血清干預(yù)24h后，與H647+FBS組比較，H647+黃土湯含藥血清組細胞遷移率明顯降低（P＜0.001）；經(jīng)過TNKS2干擾后，H647 siRNA+FBS組細胞遷移率同樣降低（P＜0.01）；同時經(jīng)過TNKS2干擾和黃土湯含藥血清干預(yù)，H647 siRNA+黃土湯含藥血清組細胞遷移率與H647 siRNA+FBS細胞組比較，進一步降低（P＜0.001）。見圖6。

圖5 A549細胞遷移能力變化（40×）Fig.5 Changes of cell migration ability of A549 cell（40×）

圖6 H647細胞遷移能力變化（40×）Fig.6 Changes of cell migration ability of H647 cell（40×）

2.5 各組細胞TNKS2蛋白及APC蛋白表達比較 Western blot檢測提示，黃土湯含藥血清+H647 siRNA干擾組和H647 siRNA干擾組比較，兩組TNKS2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但前者APC蛋白表達明顯高于H647 siRNA干擾組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃土湯含藥血清+A549過表達組和A549過表達組比較，前者TNKS2蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組APC蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組細胞TNKS2蛋白及APC蛋白表達比較Fig.7 Comparison of TNKS2 protein and APC protein expression in each group

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NSCLC患者病情惡化、死亡的主要原因。中醫(yī)認為，正氣不足、肺脾氣虛是肺癌發(fā)生發(fā)展甚至擴散轉(zhuǎn)移的重要病機[14]。根據(jù)這一病機，通過“培土生金”法健脾補肺已成為防治肺癌轉(zhuǎn)移的重要方法之一[15]。本研究結(jié)果顯示，基于培土生金理論的經(jīng)方黃土湯，能夠有效抑制NSCLC細胞的遷移能力，干預(yù)惡性化程度不同的NSCLC細胞轉(zhuǎn)移進程，說明黃土湯對肺癌轉(zhuǎn)移具有抑制作用。黃土湯立足于溫中健脾，方中以灶心黃土（現(xiàn)用赤石脂）為君，溫中止血；以白術(shù)、附子為臣，君臣相伍，溫脾陽、補中氣；佐以黃芩、生地、阿膠，清熱滋陰養(yǎng)血，并遏制術(shù)、附辛溫耗血之弊；最后以甘草調(diào)藥和中為使。諸藥配合，寒熱并用，標本兼治，剛?cè)嵯酀?，溫中健脾益肺。正如《石室秘錄》所云：“治肺之法，正治甚難，當(dāng)轉(zhuǎn)治以脾，脾氣有養(yǎng)，則土自生金?！盵16]本研究結(jié)果在體外實驗層面驗證了黃土湯乃至培土生金法對肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，TNKS2在腫瘤細胞中表達升高[17]。A549、H125、PC9及H647這4種NSCLC細胞系的惡性程度依次增加，本研究發(fā)現(xiàn)上述細胞中TNKS2的表達也相應(yīng)增加，說明TNKS2基因表達與NSCLC的惡性程度呈正相關(guān)。細胞劃痕試驗顯示，惡性程度高的H647細胞遷移能力高于A549細胞。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，A549經(jīng)過TNKS2基因過表達干預(yù)后，細胞遷移能力有所上升；而H647經(jīng)過TNKS2干擾后，其遷移能力受到一定程度的抑制，表明TNKS2表達與NSCLC細胞遷移能力成正相關(guān)。經(jīng)黃土湯含藥血清干預(yù)后，A549、H647兩種細胞的遷移能力均下降，經(jīng)TNKS2基因過表達干預(yù)后的A549細胞和經(jīng)TNKS2干擾后的H647細胞遷移能力亦下降，提示黃土湯對不同惡性程度NSCLC細胞遷移均有抑制作用。

有研究表明，TNKS2和Wnt信號通路相關(guān)蛋白APC、Axin以及β-catenin結(jié)合形成相應(yīng)的復(fù)合物，從而影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18-21]。APC是一種抑癌基因，其作用是增強降解復(fù)合體與β-catenin的親和力[22]，通過參與Wnt信號通路，影響細胞的增殖與分化，是Wnt通路中的負向調(diào)節(jié)因子[23]。簡而言之，TNKS2高表達與肺癌細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，而APC表達升高則能抑制肺癌轉(zhuǎn)移進程。本研究中的Western blot結(jié)果提示，黃土湯能抑制經(jīng)TNKS2基因過表達干預(yù)的A549細胞中TNKS2表達，能誘導(dǎo)經(jīng)TNKS2基因干擾的H647細胞中APC表達升高，表明黃土湯對惡性程度不同的肺癌細胞均有干預(yù)作用，雖然其作用目標蛋白不同，但均與激活或抑制Wnt信號通路相關(guān)。因此，筆者推測黃土湯影響NSCLC細胞轉(zhuǎn)移的機制與抑制細胞內(nèi)TNKS2表達或促進抑癌蛋白APC表達有關(guān)。具體而言，惡性化程度低的NSCLC，其TNKS2表達低，黃土湯可能通過上調(diào)抑癌蛋白APC而起效；惡性化程度高的NSCLC，其TNKS2表達高，黃土湯則通過直接抑制TNKS2表達而起效。進一步推測，黃土湯可能毒副作用較低，在發(fā)揮良好治療效果的同時，對患者機體正常細胞的殺傷力較弱。

綜上所述，培土生金法對惡性程度不同的NSCLC細胞轉(zhuǎn)移均有抑制作用，可通過下調(diào)TNKS2表達或通過誘導(dǎo)抑癌蛋白APC表達，從而干預(yù)與癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的Wnt信號通路。但Wnt通路尚有多個調(diào)節(jié)蛋白參與，后續(xù)將鎖定其他相關(guān)目標蛋白進行研究，以精準化研究培土生金法干預(yù)NSCLC的療效靶點。