高蘭 劉海蔚 紀群

(海南省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 ?？?570100)

糖尿病腎病是糖尿病全身微血管并發(fā)癥之一，已成為引起終末期腎病的重要原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的首位原因，嚴重危害人類健康〔1〕。糖尿病腎病是遺傳因素、氧化應(yīng)激、高血糖等多因素共同作用的結(jié)果，其中高血糖是引起糖尿病腎病的始動因素，控制血糖藥物可以降低高血糖對腎臟的損傷作用，從而延緩腎衰竭進展〔2～4〕。

厄貝沙坦是血管緊張素Ⅱ受體抑制劑，常用于原發(fā)性高血壓、合并高血壓的2型糖尿病腎病的治療，對合并糖尿病患者的心、腦、腎功能具有保護作用，近年來被廣泛用于糖尿病腎病的聯(lián)合治療，取得了顯著療效〔5～7〕。相關(guān)研究報道〔8〕，厄貝沙坦能夠減輕糖尿病腎病氧化應(yīng)激，改善腎微循環(huán)障礙，從而保護腎功能，減輕蛋白尿。但目前，有關(guān)厄貝沙坦保護腎功能的作用機制尚未見報道。本研究以人近端腎小管上皮細胞HKC為研究對象，體外探討厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響及其潛在作用機制，旨在闡明厄貝沙坦對糖尿病腎病的腎保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞和主要試劑 人近端腎小管上皮細胞HKC由中國科學(xué)院上海細胞庫提供；厄貝沙坦購自浙江華海藥業(yè)股份有限公司(批號：20160202)；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胰蛋白酶購自上海第一生化藥業(yè)有限公司；噻唑藍(MTT)試劑和二甲亞砜購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；白細胞介素-1復(fù)體激活激酶(IRAK1)抗體、p-p38抗體、p38抗體、β-actin抗體及二抗購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組 將人近端腎小管上皮細胞接種于用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長密度達80%～90%時，用0.25%胰酶消化收集細胞，進行傳代培養(yǎng)。取第4～5代細胞，待細胞生長密度達70%左右時，更換無血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。將細胞隨機分為對照組(在含正常糖濃度5.5 mmol/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng))、高糖組(HG組，在含糖濃度30 mmol/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng))和高糖+厄貝沙坦組〔糖濃度30 mmol/L培養(yǎng)+厄貝沙坦低濃度(10-6mol/L)、中濃度(10-5mol/L)、高濃度(10-4mol/L)處理〕。

1.3細胞轉(zhuǎn)染、分組 將HG組細胞隨機分為4組，HG+si-con組〔將小干擾RNA陰性對照組(si-con)轉(zhuǎn)染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)〕，HG+si-IRAK1組〔將IRAK1的小干擾RNA(si-IRAK1)轉(zhuǎn)染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)〕，HG+pcDNA+厄貝沙坦組〔將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并給予厄貝沙坦?jié)舛忍幚怼?，HG+pcDNA-IRAK1+厄貝沙坦組〔將pcDNA-IRAK1轉(zhuǎn)染至細胞后，在含糖濃度30 mmol/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并給予厄貝沙坦?jié)舛忍幚怼?。細胞轉(zhuǎn)染方法嚴格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

1.4MTT實驗檢測細胞增殖活性 細胞處理48 h后，用0.25%胰酶消化收集細胞，重懸細胞并調(diào)整細胞密度為2×104個/ml，接種于96孔板中，每組設(shè)置5個重復(fù)孔，細胞貼壁后每孔加入20 μl MTT試劑(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，吸去培養(yǎng)孔上層液體，每孔加入150 μl二甲亞砜，放在搖床上反應(yīng)10 min。酶標(biāo)儀下檢測每孔490 nm波長處的光密度值(OD 490)，檢測細胞增殖活性。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率 調(diào)整“1.4”中細胞懸液密度為5×105個/ml，取1 ml細胞懸液加入無菌離心管中，2 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次。采用Annexin-V-FITC和PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，首先用1×倍結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后分別加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl PI混勻，室溫，避光反應(yīng)15 min，流式細胞儀下計數(shù)細胞凋亡率。

1.6Western印跡 收集上述各組對數(shù)生長期細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白樣品濃度并進行定量，將蛋白樣品和上樣緩沖液按1∶5比例混合，100℃變性5 min，用于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉中封膜2 h，然后加入稀釋1 000倍IRAK1抗體、p-p38抗體、p38抗體和β-actin抗體一抗，4℃孵育過夜。洗膜，然后加入稀釋2 000倍辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光液中顯色，凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白灰度值并計算IRAK1、p-p38、p38蛋白相對表達水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，HG組細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；與HG組比較，厄貝沙坦各處理組細胞增殖活性明顯增加，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；厄貝沙坦中濃度和高濃度組細胞增殖活性明顯高于低濃度組，細胞凋亡率明顯低于低濃度組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測腎小管上皮細胞凋亡率

表1 不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響

2.2不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞IRAK1表達和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的影響 與對照組比較，HG組細胞中IRAK1、p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與HG組比較，厄貝沙坦各處理組細胞中IRAK1、p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；厄貝沙坦中濃度和高濃度組細胞中IRAK1、p-p38蛋白表達水平明顯低于低濃度組(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測腎小管上皮細胞IRAK1表達和p38蛋白表達

表2 不同濃度厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞IRAK1表達和MAPK信號通路蛋白表達的影響

2.3沉默IRAK1表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響 與HG+si-con組比較，HG+si-IRAK1組細胞中IRAK1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測腎小管上皮細胞IRAK1表達

表3 沉默IRAK1表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響

2.4沉默IRAK1表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞MAPK信號通路的影響 與HG+si-con組比較，HG+si-IRAK1組細胞中p-p38蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表4。

圖4 Western印跡檢測腎小管上皮細胞p38蛋白表達

表4 沉默IRAK1過表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞MAPK信號通路的影響

2.5厄貝沙坦和IRAK1過表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響 因厄貝沙坦中濃度(10-5mol/L)和高濃度(10-4mol/L)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響無明顯差異，故選擇厄貝沙坦中濃度進行后續(xù)實驗。與HG+厄貝沙坦+pcDNA組比較，HG+厄貝沙坦 + pcDNA-IRAK1組細胞中IRAK1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。見圖5、表5。

2.6厄貝沙坦和IRAK1過表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞MAPK信號通路的影響 與HG+厄貝沙坦+pcDNA組比較，HG+厄貝沙坦+pcDNA-IRAK1組細胞中p-p38蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，p38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5、圖6。

1～4：HG組、HG+厄貝沙坦組、HG+厄貝沙坦+pcDNA組、HG+厄貝沙坦+pcDNA-IRAK1組；圖6同圖5 Western印跡檢測腎小管上皮細胞IRAK1表達

表5 厄貝沙坦和IRAK1過表達對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖和凋亡、MAPK信號通路的影響

圖6 Western印跡檢測腎小管上皮細胞p38蛋白表達

3 討 論

腎小球上皮細胞是構(gòu)成腎小球濾過膜的重要組成部分，其增殖和凋亡平衡是維持腎小球微環(huán)境穩(wěn)定的重要保障，對腎臟功能非常重要〔9〕。高糖可引起腎小球上皮細胞凋亡和增殖抑制，促進糖尿病腎病進展。本研究結(jié)果說明厄貝沙坦能夠保護高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷。IRAK1是先天免疫的重要信號傳導(dǎo)介質(zhì)，可通過激活相關(guān)信號途徑在促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔10～12〕。本研究結(jié)果說明靶向IRAK1對高糖誘導(dǎo)的腎小球上皮細胞損傷有保護作用，可能改善糖尿病腎病炎癥反應(yīng)。腎纖維化是糖尿病腎病的主要特征之一，研究表明，高糖刺激可通過激活蛋白激酶C、葡萄糖氧化磷酸化等途徑，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生過多，使腎臟固有細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進而激活p38MAPK信號通路等，促進炎癥因子和致纖維化細胞因子的表達，導(dǎo)致腎纖維化形成〔13～15〕。本研究結(jié)果說明厄貝沙坦能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中p38MAPK信號通路激活，可能具有改善糖尿病腎病腎纖維化的作用。

IRAK1蛋白激活介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔16〕。本研究結(jié)果提示厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)的腎小球上皮細胞的保護作用可能與IRAK1及p38MAPK通路有關(guān)。Jeong等〔17〕報道，IRAK1在2，3，4-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎細胞中被活化，而抑制IRAK1活性，可通過抑制NF-kB活性和p38磷酸化改善結(jié)腸炎。Awasthi等〔18〕報道，氧化低密度脂蛋白通過激活TLR-PKC-IRAK-MAPK信號途徑誘導(dǎo)中性粒細胞胞外陷阱形成。提示在炎癥性疾病和免疫性疾病中IRAK1活性增強可通過介導(dǎo)MAPK信號通路激活而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默IRAK1后明顯降低了高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中p38磷酸化水平。相關(guān)研究報道，抑制腎組織中p38MAPK信號通路活性，可通過抑制炎癥因子和至纖維化細胞因子表達，改善糖尿病腎病小鼠腎纖維化狀態(tài)〔19，20〕。本研究進一步探究發(fā)現(xiàn)，IRAK1過表達逆轉(zhuǎn)了厄貝沙坦對高糖誘導(dǎo)的腎小球上皮細胞增殖、凋亡及p38磷酸化的影響，推測厄貝沙坦可能通過抑制IRAK1/p38MAPK信號通路，對高糖誘導(dǎo)的腎小球上皮細胞損傷起保護作用。此外，有研究報道〔21〕，抑制IRAK1活性還可通過PI3K/Akt信號通路降低糖尿病腎病足細胞凋亡，減緩糖尿病腎病進展。

綜上，厄貝沙坦能夠有效抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡，增強細胞增殖活性，可能通過抑制IRAK1/p38MAPK信號通路，發(fā)揮抗炎、抗凋亡、抗腎纖維化及促進增殖的作用，從而保護腎臟功能。本研究結(jié)果為厄貝沙坦在糖尿病腎病治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但厄貝沙坦的潛在毒性作用有待于進一步探討。