郭登方 王若濤 黃建成 王瑞華 張揚(yáng)平 張春

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市閩東醫(yī)院 1普外科，福建 寧德 355000；2檢驗(yàn)科)

盡管近年來(lái)治療肝細(xì)胞癌(HCC)的方法有大幅度改善〔1,2〕，但終末期HCC患者死亡率依然很高，且HCC早期診斷率低，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多已進(jìn)入HCC終末期，極易擴(kuò)散，使HCC治愈變得異常艱難〔3〕，因此尋找新的治療途徑變得非常迫切。姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的天然化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種藥理作用，且對(duì)人體毒性小〔2〕。姜黃素衍生物-4(4-甲基-3氧基苯甲基，C086)是一種新合成的姜黃素衍生物，其生物活性優(yōu)于姜黃素，具有良好抗突變和抗腫瘤作用〔4〕。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是一種重要的凋亡抑制通路，在腫瘤細(xì)胞的增殖、活化和遷移等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用〔5〕。本研究利用C086處理HCC HepG2細(xì)胞，擬觀察C086對(duì)HCC HepG2細(xì)胞凋亡的影響并初步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 人HepG2細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC，RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào)：11875193)、胎牛血清(FBS，批號(hào)：10099-145)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；姜黃素C086(批號(hào)：20180305，純度≥98.5%)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：ST038)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒(批號(hào)：C0009)、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(批號(hào)：P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0010S)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C1062S)購(gòu)自上海碧云天；鼠源一抗β-actin抗體、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2抗體、 Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、PI3K抗體、p-PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、細(xì)胞色素(Cyt)C抗體，二抗羊抗鼠IgG(批號(hào)：B-2752)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；酶標(biāo)儀、5%CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔接種細(xì)胞數(shù)量約0.5×105個(gè)，每孔體積200 μl；細(xì)胞完全貼壁后更換培養(yǎng)基并加入不同濃度C086(0、10、20、40 μmol/L)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每組6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，每孔加200 μl DMSO，輕微震蕩10 min，待MTT沉淀物徹底溶解后上酶標(biāo)儀，檢測(cè)各孔570 nm吸光度(A)值，并記錄結(jié)果。細(xì)胞增殖率=(C086 A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡 檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞約2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合至80%時(shí)，C086處理及對(duì)照組設(shè)置同上。培養(yǎng)48 h后每孔500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl PI，避光輕輕振蕩混勻，室溫放置15 min。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(無(wú)Annexin V-FITC和PI)，放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡率。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞按5×105個(gè)/ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，添加培養(yǎng)基3 ml、C086(0、10、20、40 μmol/L)各100 μl培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞匯合至90%，重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 mmol/L羅丹明123，37℃孵育15 min，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，放置流式細(xì)胞儀FL1通道檢測(cè)。

1.2.4Western印跡檢測(cè)HepG2細(xì)胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、Cyt C蛋白表達(dá) 收集不同濃度C086處理過(guò)的細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后，嚴(yán)格按照蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總蛋白，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，提取的蛋白置于-80℃保存?zhèn)溆谩＜尤?/5體積6×SDS上樣緩沖液，95℃ 5 min，冷卻離心后置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?80 μg蛋白樣品，以β-actin做為內(nèi)參，6% SDS-PAGE 電泳。用濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋?zhuān)右豢?PI3K、p-PI3K抗體1∶500；AKT、p-AKT抗體1∶1 000；Bcl-2抗體1∶500；Bax抗體1∶500；Cyt C抗體1∶500；β-actin抗體1∶500)4℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜3次，每次20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育 1.5 h，按上述方法洗膜，用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，數(shù)字化多功能圖像增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝片，觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1C086對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的作用 MTT結(jié)果顯示，與0 μmol/L 組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086處理組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；與10 μmol/L 組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086處理組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；與20 μmol/L組比較，40 μmol/L C086處理組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度C086對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2C086對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與0 μmol/L 組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與20 μmol/L組比較，40 μmol/L C086 組HCC HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)C086對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

表2 不同濃度C086對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞膜電位的影響

2.3C086對(duì)HCC HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與0 μmol/L組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086 組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位均顯著降低(均P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086 組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位均顯著降低(均P<0.05)；與20 μmol/L組比較，40 μmol/L C086 組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4C086對(duì)Bax、Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3及Cyt C蛋白表達(dá)的影響 與0 μmol/L組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086 組Bcl-2蛋白水平均顯著下調(diào)，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086 組Bcl-2蛋白水平均顯著下調(diào)，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均顯著上調(diào)(均P<0.05)；與20 μmol/L比較，40 μmol/L C086組Bcl-2蛋白水平均顯著下調(diào)，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均顯著上調(diào)(均P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

1～4：0 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組、下圖同圖2 Western印跡檢測(cè)caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 C086對(duì)HepG2細(xì)胞caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.5C086對(duì)PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)的影響 與0 μmol/L組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086組p-PI3K及p-AKT蛋白水平均顯著下調(diào)(均P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086 組p-PI3K及p-AKT蛋白水平均顯著下調(diào)(均P<0.05)；與20 μmol/L比較，40 μmol/L C086 組p-PI3K及p-AKT蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)；0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086各組PI3K、AKT蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 Western印跡檢測(cè)PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)表達(dá)

表4 C086對(duì)HepG2細(xì)胞PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

HCC是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類(lèi)，其中原發(fā)性肝癌在我國(guó)發(fā)病率極高，死亡率也高，嚴(yán)重危協(xié)人類(lèi)健康〔6〕。HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程極其復(fù)雜，目前治療方式主要包括手術(shù)切除、放化療及肝臟移植等，但療效都不理想，因此尋找新的治療方法和途徑成為目前迫切需要解決的問(wèn)題〔7〕。許多研究報(bào)道，一些植物提取物，比如姜黃素〔8〕、白蘆藜醇〔9〕、綠茶〔10〕等藥理作用廣泛且對(duì)人體毒性低，在癌癥及腫瘤預(yù)防和治療過(guò)程中起到非常積極的作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。

姜黃素是一種多酚類(lèi)植物提取物，具有抗突變和抑制腫瘤作用，研究發(fā)現(xiàn)，它在多種腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞及臨床實(shí)體腫瘤中均具有抗腫瘤活性〔11〕，應(yīng)用前景廣闊。C086是以姜黃素為先導(dǎo)新合成的一種姜黃素衍生物，王曉露等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)C086可通過(guò)抑制癌基因C-myc和STAT-3蛋白表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞Panc-1的侵襲和轉(zhuǎn)移。C086在肝癌細(xì)胞中的作用尚鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度C086處理HCC HepG2細(xì)胞，可濃度依賴性抑制HCC HepG2細(xì)胞增殖、促進(jìn)HCC HepG2細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制不清楚。

Da等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起非常關(guān)鍵作用，線粒體膜電位與線粒體膜通透性呈負(fù)相關(guān)，線粒體膜通透性取決于線粒體外膜與內(nèi)膜間隙由多種蛋白組成的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)的開(kāi)放〔13〕。線粒體間隙存在CytC、鈣離子、細(xì)胞促凋亡因子等，MPTP開(kāi)放導(dǎo)致線粒體膜電位改變，使線粒體內(nèi)部Cyt C和促凋亡因子等外流，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡通路，增加促凋亡蛋白的表達(dá)〔14〕。Bcl-2的生理功能是阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命〔15〕，它在不同細(xì)胞類(lèi)型中可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核膜上，通過(guò)阻止線粒體Cyt C的釋放發(fā)揮抗凋亡作用〔16〕。caspase-3在細(xì)胞凋亡中起不可替代的作用，是一種凋亡執(zhí)行蛋白；Bax是人體主要凋亡基因，屬于Bcl-2家族，與Bcl-2是拮抗關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素〔10〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C086呈濃度依賴地降低HCC HepG2細(xì)胞線粒體膜電位，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)caspase-3、Bax和Cyt C蛋白表達(dá)，提示C086可增加線粒體通透性，使線粒體膜電位改變，Cyt C外流，上調(diào)caspase-3、Bax和阻止Bcl-2蛋白表達(dá)。

PI3K-AKT通路廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞的增殖分化過(guò)程〔17〕。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT通路在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到非常重要的作用。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可使自身和其他多種蛋白磷酸化發(fā)揮生物學(xué)活性，AKT在PI3K-AKT通路中發(fā)揮非常關(guān)鍵作用，AKT活性升高可以抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。PI3K同時(shí)具有脂類(lèi)激酶活性和蛋白激酶活性，在被激活可使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化后變成第二信使，與其下游效應(yīng)分子AKT結(jié)合后使AKT發(fā)生磷酸化變成p-AKT，進(jìn)而可編碼下游凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2等〔18〕。本研究結(jié)果提示C086可能通過(guò)抑制PI3K-AKT通路抑制HepG2細(xì)胞增殖、促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。Zhou等〔19〕研究指出，猴頭菌素可以促進(jìn)MPTP開(kāi)放，使Cyt C釋放增加，進(jìn)而激活PI3K-Akt通路抑制HCC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡；Liu等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可通過(guò)誘導(dǎo)PI3K-AKT和GSK-3β發(fā)生磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)MPTP開(kāi)放，防止心肌缺血-再灌注損傷。因此本研究推測(cè)C086可能通過(guò)PI3K-AKT通路促進(jìn)MPTP開(kāi)放，增加線粒體膜通透性，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞中caspase-3、Cyt C、Bax蛋白增加和Bcl-2蛋白減少，抑制HepG2細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。