倪宇昕 章立群 謝安琪 劉學(xué) 楊旭

(1華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518000；2深圳大學(xué)第六附屬醫(yī)院口腔科；3吉林大學(xué)口腔醫(yī)院種植科)

牙列缺失及牙列缺損是老年人常見的口腔疾病，主要表現(xiàn)為單個(gè)或多個(gè)牙的功能缺失，繼而影響老年人的咀嚼功能和消化系統(tǒng)。種植技術(shù)已經(jīng)漸漸成為臨床主要的治療方法之一，具有諸多優(yōu)點(diǎn)。但各種原因引起的種植體周圍炎會(huì)導(dǎo)致種植體松動(dòng)脫落，影響臨床效果〔1,2〕。巨噬細(xì)胞在種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色〔3,4〕，在脂多糖(LPS)刺激下會(huì)向M1型進(jìn)行極化，表現(xiàn)為白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等促炎因子表達(dá)升高〔5～7〕，最終促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。因此，發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細(xì)胞M1極化的分子具有較好的應(yīng)用前景。近年來，聚多巴胺(PDA)納米顆粒因其生物相容性高、合成簡(jiǎn)單和具備活性氧物種清除能力而備受關(guān)注〔8～10〕，本研究對(duì)PDA納米顆粒調(diào)控巨噬細(xì)胞M1極化進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 NH4OH和鹽酸多巴胺購(gòu)自Sigma公司(上海，中國(guó))；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液購(gòu)自賽默飛公司(上海，中國(guó))；胎牛血清(FBS)購(gòu)自天杭生物(杭州，中國(guó))；LPS和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(北京，中國(guó))；掃描電鏡(SEM)：XL-30場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；透射電鏡(TEM)：Tecnai G2 F20 S-TWIN 場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡。

1.2PDA納米顆粒的合成方法 是在經(jīng)典的St?ber方法基礎(chǔ)上加以改良的。室溫下將2 ml的NH4OH、40 ml乙醇和90 ml去離子水混合攪拌30 min。同時(shí)將鹽酸多巴胺(0.5 g)加入去離子水(10 ml)中制備溶液。將上述兩溶液混合并攪拌24 h，隨后采用離心方法分離聚多巴胺，去離子水洗滌后過夜凍干。使用前稱重溶解后濾器過濾除菌。

1.3PDA的表征 將合成的PDA納米顆粒進(jìn)行SEM、TEM表征，以檢測(cè)其形貌、粒徑分布。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%雙抗)，置于條件為37℃和5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞毒性檢測(cè) 將Raw264.7細(xì)胞以104/孔的密度在96孔板中鋪板，貼壁后在培養(yǎng)液中加入不同濃度的PDA(25、50、100、200 ng/ml)。細(xì)胞繼續(xù)孵育48 h后，用噻唑藍(lán)(MTT)溶液處理細(xì)胞，使其形成Forazan晶體。用二甲基亞砜(DMSO)溶解后用 Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。以未處理的細(xì)胞為對(duì)照組計(jì)算相對(duì)增殖率(n=6)。

1.6巨噬細(xì)胞M1極化檢測(cè) 用含50 μg/ml LPS和20 ng/ml干擾素(IFN)γ的DMEM條件培養(yǎng)液刺激巨噬細(xì)胞構(gòu)建M1極化模型，以不含PDA的條件培養(yǎng)液為對(duì)照組，以含25、50、100、200 ng/ml的PDA條件培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)48 h后，小心吸取上清液后離心，隨后保留上清液應(yīng)用ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)。按試劑盒中說明，建立標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，加入待測(cè)上清液后進(jìn)行洗板和顯色等步驟，最后利用酶標(biāo)儀讀數(shù)，每組重復(fù)3次。同時(shí)將貼壁的細(xì)胞用Trizol裂解后提取總RNA，隨后反轉(zhuǎn)成(cDNA)，最后應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)。引物序列見表1，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 各引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PDA合成及電鏡表征 實(shí)驗(yàn)中成功合成了PDA納米顆粒，在水溶液中具有良好的分散性。電鏡結(jié)果顯示合成的PDA呈大小均一的球形，直徑在200 nm左右。見圖1。

2.2細(xì)胞毒性 將不同濃度的PDA納米顆粒(25、50、100、200 ng/ml)與細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組與25、50、100、200 ng/ml PDA組Raw264.7細(xì)胞增殖率分別為(1.00±0.24)、(1.08±0.14)、(0.03±0.38)、(0.98±0.19)、(0.99±0.15),Raw264.7細(xì)胞增殖能力未有顯著變化。

2.3巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)mRNA變化 聯(lián)合應(yīng)用LPS和IFNγ誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞M1極化時(shí)，3種炎癥因子的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)液和PDA納米顆粒共培養(yǎng)時(shí)，3種炎癥因子的mRNA升高被逐漸抑制，并呈現(xiàn)PDA濃度依賴性。見表2。

表2 Raw264.7細(xì)胞的熒光定量PCR結(jié)果

2.4Raw264.7細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下炎癥因子水平比較 與熒光定量PCR結(jié)果相似，LPS與IFNγ的組合能夠明顯的刺激巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，而PDA納米顆粒能夠抑制這一作用，并且隨著PDA濃度的增加，抑制作用也越發(fā)明顯，見表3。

表3 Raw264.7細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下炎癥因子水平比較

3 討 論

種植體周圍炎的始發(fā)因素是菌斑生物膜，隨后引發(fā)自身的局部炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在炎癥的活化和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。當(dāng)LPS存在時(shí)，巨噬細(xì)胞的IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)會(huì)明顯升高，向M1型進(jìn)行極化并加重炎癥反應(yīng)。所以開發(fā)合適的能夠抑制巨噬細(xì)胞M1極化的分子或藥物尤為重要，有望通過抗炎作用預(yù)防或治療種植體周圍炎。傳統(tǒng)的治療雖具有一定的抗炎效果〔11～13〕，但仍存在一些缺點(diǎn)，包括潛在的毒副作用、價(jià)格昂貴和給藥困難等。因此，開發(fā)新的抗炎策略意義重大。

PDA是源自海洋貝類生物的一種聚合物，從被發(fā)現(xiàn)以來受到了廣泛的關(guān)注〔14〕。PDA具有生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，即便較大劑量也不會(huì)影響細(xì)胞的增殖等過程，其另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可降解性，能夠在生物體內(nèi)降解從而避免潛在的毒性和不良反應(yīng)。此外，PDA納米顆粒的尺寸優(yōu)勢(shì)又賦予其易運(yùn)載、合成成本低的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。近年來的研究證實(shí)PDA能夠清除細(xì)胞中的活性氧(ROS)繼而發(fā)揮抗炎作用，已被成功應(yīng)用于腦卒中和肺炎的治療中〔15，16〕，成為極具應(yīng)用潛力的一類生物材料。

本研究結(jié)果證實(shí)PDA能夠明顯下調(diào)IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA與蛋白表達(dá)，即PDA納米顆粒能夠抑制巨噬細(xì)胞的M1極化。PDA納米顆粒調(diào)控炎癥反應(yīng)有效，為進(jìn)一步應(yīng)用PDA開展種植體周圍炎的治療奠定了基礎(chǔ)，但是由于體內(nèi)外環(huán)境的差異，仍然需要更多的研究來確定PDA納米顆粒治療種植體周圍炎的可行性及其作用的分子機(jī)制。