向麗 曹麗蓉 王中顯 黃浩梁 王平

(武漢市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430000)

細(xì)菌性陰道炎在婦科臨床中為常見病及多發(fā)病，大多是細(xì)菌感染所致〔1〕，患者出現(xiàn)外陰瘙癢、白帶增多、陰道分泌物異常等癥狀，病情嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致宮頸炎、附件炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響婦女的身心健康〔2〕?？鄥⒛z的有效成分主要為苦參堿，是純中藥制劑，可殺蟲止癢、清熱利濕〔3〕，臨床中常用來(lái)治療慢性婦科炎癥，可恢復(fù)陰道內(nèi)環(huán)境，改善其微生態(tài)平衡，進(jìn)而減輕細(xì)菌性陰道炎患者的臨床癥狀，降低其復(fù)發(fā)率〔4〕?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1是一種炎性趨化因子，CXC趨化因子受體(CXCR)4是其受體，在多種細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞募集、遷移、增殖等生理活動(dòng)〔5〕，另外研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸在炎癥反應(yīng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用，外源性SDF-1可引起骨性關(guān)節(jié)炎，下調(diào)SDF-1/CXCR4表達(dá)，可減輕炎癥反應(yīng)，延緩牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙周炎病情進(jìn)程〔6〕，因而推測(cè)SDF-1/CXCR4軸可介導(dǎo)細(xì)菌性陰道炎。研究表明，苦參堿可抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901中CXCR4 mRNA表達(dá)，并誘導(dǎo)其凋亡〔7〕，在對(duì)HL-60細(xì)胞體外遷移研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液可通過上調(diào)miR-146a表達(dá)而抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，進(jìn)而減弱其遷移能力〔8〕，但在細(xì)菌性陰道炎中，SDF-1/CXCR4的表達(dá)及苦參凝膠對(duì)其的作用，目前還未有明確報(bào)道，本文探討苦參凝膠處理對(duì)細(xì)菌性陰道炎大鼠陰道黏膜SDF-1/CXCR4軸的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘) 2019-0013，使用許可證號(hào)SCXK(湘) 2019-0013，雌性，體重180～220 g，飼養(yǎng)于醫(yī)院動(dòng)物中心，動(dòng)物房溫度設(shè)置為25℃，相對(duì)濕度設(shè)置為55%，噪音低于80 dB，自然光照、氨濃度小于20 ppm，氣流速度10～25 cm/s，每小時(shí)通風(fēng)換氣8～12次，自然飲食、飲水，定期更換墊料，清洗、消毒鼠籠。

1.2主要藥品及試劑 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌(批號(hào)：25923、25922、27853)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；苦參凝膠(國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20050058，每支5 g，批號(hào)：180127)購(gòu)自貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司；氧氟沙星栓(批號(hào)：180312)購(gòu)自江西吉安三力制藥有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：BS1007)購(gòu)自青島捷世康生物科技有限公司；血瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：WD-0131)購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗、兔源anti-CXCR4一抗、兔源anti-GAPDH一抗、兔源anti-SDF-1一抗、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(批號(hào)：ab150077、ab197203、ab181602、ab9797、ab100772、ab100785)購(gòu)自Abcam公司；SDF-1、CXCR4、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒(批號(hào)：9108、9014、9519)購(gòu)自Takara公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào)ZY7070)購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；RIPA裂解液(批號(hào)GL1476)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；BCA試劑盒(批號(hào)：LCB004)購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 DNA合成儀(型號(hào)MerMade-192E)購(gòu)自北京梓熙生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀(型號(hào)VARIOSKANLUX、QuantStudio 3)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；轉(zhuǎn)膜儀、蛋白電泳儀(型號(hào)：Trans-Blot SD、1659001)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；實(shí)驗(yàn)室教學(xué)生物顯微鏡(型號(hào)Eclipse E200)購(gòu)自日本尼康公司；石蠟切片機(jī)(型號(hào)RM2235)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)JS-1090P)購(gòu)自上海培清科技有限公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)菌性陰道炎大鼠模型建立及分組給藥 感染菌液的制備〔9〕：將葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌3種菌株復(fù)蘇后以無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)、傳代，并配制濃度為2.0 × 109個(gè)/ml的菌液，接著將3種菌液按1∶1∶1的比例混合成感染菌液備用。

參照文獻(xiàn)〔10〕：以45 mg/kg的劑量腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在無(wú)菌操作臺(tái)中摘除大鼠雙側(cè)卵巢，術(shù)后第4天開始每天以10 mg/kg的劑量皮下注射苯甲酸雌二醇，持續(xù)4 d后，以60 mg/kg的劑量皮下注射氫化可的松注射液，隔日1次，持續(xù)3 d，復(fù)制大鼠免疫功能低下模型。2 d后將50 μl感染菌液注入大鼠陰道內(nèi)，提起大鼠尾部停留約2 min，防止菌液溢出，1 d后以相同方法再感染1次，然后隔日交替皮下注射苯甲酸雌二醇、氫化可的松注射液各1次，建模結(jié)束后觀察大鼠外陰情況，若呈現(xiàn)腫脹發(fā)紅，并有白色分泌物滲出，取少量分泌物涂布在血瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)，72 h后肉眼觀察到培養(yǎng)基上分布有大小不等的菌落，則表明模型建立成功，共成功建立模型大鼠60只，隨機(jī)分為模型組、氧氟沙星栓劑(0.02 g/kg)組、苦參凝膠低(0.25 g/kg)、中(0.50 g/kg)、高(1.00 g/kg)劑量組，每組12只，另取12只設(shè)為假手術(shù)組，只進(jìn)行手術(shù)操作，不摘除卵巢，大鼠陰道內(nèi)注入50 μl無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，其他操作同模型組。參照文獻(xiàn)，苦參凝膠低、中、高劑量組分別以0.25、0.50、1.00 g/kg的劑量陰道內(nèi)給藥〔11〕，氧氟沙星栓劑組以0.02 g/kg的劑量陰道內(nèi)給藥〔9〕，模型組和假手術(shù)組大鼠陰道內(nèi)置入等體積的賦形劑，持續(xù)7 d。

1.4.2大鼠陰道分泌物細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率檢測(cè) 末次給藥24 h后，各組大鼠以無(wú)菌棉棒分別取陰道分泌物，涂抹在血瓊脂培養(yǎng)基上(無(wú)菌操作)，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后肉眼觀察是否出現(xiàn)菌落，連續(xù)兩次檢測(cè)均無(wú)細(xì)胞菌落出現(xiàn)，表示轉(zhuǎn)陰。轉(zhuǎn)陰率計(jì)算公式如下：轉(zhuǎn)陰率=出現(xiàn)細(xì)菌移位的大鼠數(shù)/各組大鼠總數(shù)(12)×100%。

1.4.3標(biāo)本采集及HE染色 末次給藥24 h后，各組大鼠分別自尾靜脈每只采血1.5 ml，3 000 r/min，4℃下離心15 min后吸出上清液(血清)，置于Ep管中，保存在-80℃的冰箱中。以乙醚麻醉各組大鼠，隨后處死，分離并取下陰道黏膜組織，每只大鼠各取約1 g黏膜組織，保存于液氮中，剩余組織采用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，以濾紙吸干，置于10%甲醛溶液固定24 h，使用80%、90%、95%、100%的乙醇溶液依次脫水1.5 h，用透明劑二甲苯孵育2 h透明后，采用石蠟包埋組織塊，最后放入切片機(jī)中切片，選出完整、厚薄均勻的切片，使用二甲苯去除其中的石蠟，依次放入100%、95%、90%、80%的乙醇溶液中處理后轉(zhuǎn)移到蒸餾水中浸泡漂洗，按照試劑盒說(shuō)明書的指導(dǎo)步驟做HE染色，然后將切片按上述操作方法再次脫水、透明后封片。

1.4.4大鼠陰道黏膜組織損傷情況檢測(cè)1.4.2中的陰道黏膜組織HE染色后的切片鏡下觀察并拍照，根據(jù)陰道黏膜組織平整度、下層、肌層等充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變情況，對(duì)其炎癥程度進(jìn)行評(píng)分，鏡下見：陰道黏膜平滑，無(wú)充血腫脹癥狀評(píng)為0分；鏡下見：陰道黏膜尚平滑，有輕度充血腫脹癥狀評(píng)為1分；鏡下見：陰道黏膜尚平滑，有中度充血腫脹癥狀，并出現(xiàn)點(diǎn)狀出血點(diǎn)評(píng)為2分；鏡下見：陰道黏膜不平滑，有重度充血腫脹癥狀，出現(xiàn)大量出血點(diǎn)評(píng)為3分。

1.4.5大鼠血清TNF-α、IL-6水平檢測(cè) 取出1.4.3中保存的血清在4℃下解凍，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定血清TNF-α和IL-6水平。

1.4.6大鼠陰道黏膜組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平檢測(cè) 取0.5 g1.4.3中凍存的陰道黏膜組織在研缽中研碎，按照說(shuō)明書的指導(dǎo)步驟做以RNAiso Plus提取其中總RNA，然后將其按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的指導(dǎo)步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書的指導(dǎo)配制反應(yīng)體系，并設(shè)定反應(yīng)條件，內(nèi)參基因選擇GADPH，通過2-ΔΔCt算法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。qRT-PCR引物序列：SDF-1：正義鏈：5'-GCATTGACCCGAAGCTAAAG-3'，反義鏈:5'-ACACACACACCTGGTCCTCA-3'，CXCR4：正義鏈：5'-GAGAAGCATGACGGACGGACAAGTA-3'，反義鏈：5'-GCAAAGATGAAGTCGGGAATAG-5'，GADPH：正義鏈：5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3';反義鏈：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG。

1.4.7大鼠陰道黏膜組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平檢測(cè)1.4.3中剩余的約0.5 g凍存組織，加入含有一定濃度蛋白酶抑制劑的裂解液，冰水浴中勻漿，將勻漿液放入4℃離心機(jī)中，于3 000 r/min下離心20 min，按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說(shuō)明書的指導(dǎo)步驟測(cè)定上清液中蛋白總濃度并根據(jù)測(cè)定結(jié)果調(diào)整蛋白樣本為相同濃度，配制適宜濃度的十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)濃縮膠、分離膠，蛋白樣本變性煮沸后，進(jìn)行電泳使蛋白分離，接著濕轉(zhuǎn)，使蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，以5%的脫脂奶粉室溫孵育硝酸纖維膜2 h，封閉膜上蛋白，根據(jù)分子量剪下目的蛋白條帶，分別使用兔源anti-GAPDH一抗、兔源anti-CXCR4一抗、兔源anti-SDF-1一抗4℃孵育蛋白條帶過夜，TBST溶液洗膜后使用羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗膜后，采用ECL法顯色，在凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)并采集圖像，以Image-Pro plus 軟件分析圖像灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1苦參凝膠對(duì)陰道黏膜組織病理形態(tài)的影響 與假手術(shù)組〔炎癥評(píng)分〔(0.36±0.04)分〕相比，模型組陰道黏膜組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血破潰，黏膜不平滑，炎癥評(píng)分〔(2.83±0.11)分〕顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組〔苦參凝膠低、中、高劑量組炎癥評(píng)分為(2.08±0.09)分、(1.72±0.08)分、(0.55±0.05)分；氧氟沙星栓劑炎癥評(píng)分為(0.54±0.03)分〕，陰道黏膜組織上述病理癥狀減輕，炎癥評(píng)分均顯著降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道黏膜組織上述病理癥狀減輕程度相似，炎癥評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組陰道黏膜組織病理形態(tài)(HE，×200)

2.2苦參凝膠對(duì)陰道中細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率的影響 模型組大鼠陰道中細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率為0；與模型組相比，藥物處理組大鼠陰道中細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率顯著升高，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道中細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 苦參凝膠對(duì)大鼠陰道中細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率的影響〔n(%),n=12〕

2.3苦參凝膠對(duì)大鼠血清IL-6和TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清IL-6和TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組大鼠血清IL-6和TNF-α水平降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠血清IL-6和TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較

2.4苦參凝膠對(duì)大鼠陰道黏膜組織SDF-1和CXCR4 mRNA水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平比較

2.5苦參凝膠對(duì)大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物處理組大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白表達(dá)降低，且苦參凝膠各組之間呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦參凝膠高劑量組和氧氟沙星栓劑組相比，大鼠陰道黏膜組織中SDF-1和CXCR4 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

1～6：假手術(shù)組；模型組；苦參凝膠低劑量組；苦參凝膠中劑量組；苦參凝膠高劑量組；氧氟沙星栓劑組圖2 Western印跡檢測(cè)各組陰道黏膜組織SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠黏膜組織中SDF-1、CXCR4 蛋白水平比較

3 討 論

陰道炎是婦科最常見的下生殖道感染性疾病，女性患病率約為18%，是各種陰道黏膜炎性疾病的總稱，其中細(xì)菌性陰道炎約占40%，近年來(lái)我國(guó)婦女發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性的生殖健康〔13，14〕。細(xì)菌性陰道炎大多是感染葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等多種細(xì)菌引起，在中醫(yī)上屬于陰癢、帶下病范疇，由脾虛生濕，濕熱下注，邪毒內(nèi)侵，外陰不潔、濕蘊(yùn)生蟲等所致，以清熱解毒，除濕止癢為治療原則〔15〕，苦參作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，性寒味苦，具有清熱解毒、祛風(fēng)殺蟲、燥濕利尿等多種功效，在臨床上可用來(lái)治療多種婦科炎癥〔16〕，苦參凝膠是一種藥物賦形劑，有效成分為苦參總堿，研究表明，可用來(lái)治療細(xì)菌性陰道炎，和甲硝唑片聯(lián)合應(yīng)用可降低其陽(yáng)性率及復(fù)發(fā)率，提高臨床治療效果〔17〕。本研究結(jié)果表明葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌可引起細(xì)菌性陰道炎，使大鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致陰道黏膜出現(xiàn)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等癥狀，陰道內(nèi)給藥治療可殺滅細(xì)菌，減輕炎癥反應(yīng)，修復(fù)陰道黏膜功能，進(jìn)一步證明了其對(duì)細(xì)菌性陰道炎的治療作用。

SDF-1對(duì)炎性細(xì)胞活化和遷移起到重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死病理過程中SDF-1/CXCR4 軸被激活，其對(duì)心肌梗死的病情發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用〔18〕。另外SDF-1/CXCR4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中高表達(dá)，可調(diào)節(jié)病情的進(jìn)展〔19〕，而苦參可調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4 軸的激活，薛天陽(yáng)等〔20〕發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制體外培養(yǎng)人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此可推測(cè)下調(diào)SDF-1/CXCR4 軸，可能是苦參凝膠治療細(xì)菌性陰道炎的藥理機(jī)制之一。本研究表明苦參凝膠可下調(diào)細(xì)菌性陰道炎大鼠陰道黏膜組織中SDF-1及CXCR4表達(dá)，揭示苦參凝膠治療細(xì)菌性陰道炎的藥理機(jī)制之一可能是下調(diào)SDF-1/CXCR4通路。

綜上所述，苦參凝膠能殺滅致病菌，降低大鼠炎癥反應(yīng)，修復(fù)陰道黏膜功能，對(duì)治療細(xì)菌性陰道炎具有較好的療效，下調(diào)SDF-1及CXCR4信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制之一。本研究證實(shí)了苦參凝膠對(duì)細(xì)菌性陰道炎的治療作用，并對(duì)SDF-1/CXCR4 軸在其中的作用進(jìn)行了初步探索，但更確切的分子機(jī)制未涉及，還需要進(jìn)一步研究。