徐娜娜 李聰 顧兵

(徐州醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院國(guó)家級(jí)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)分中心，江蘇 徐州 221004；2附屬醫(yī)院ICU；3附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)被稱(chēng)為炎癥性腸病(IBD)，是一種自身免疫性疾病，與長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的胃腸道功能紊亂有關(guān)〔1〕。IBD腸道病理表現(xiàn)由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞腸壁浸潤(rùn)引起，最終引起黏膜破壞和潰瘍。UC的主要臨床特征包括腹痛、腹瀉、潰瘍、反復(fù)發(fā)作和復(fù)發(fā)〔2〕。近年來(lái)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者常伴有不同程度的精神情感障礙，如焦慮和抑郁等〔3〕，而且這些異常的心理因素會(huì)延長(zhǎng)病程，誘導(dǎo)疾病復(fù)發(fā)〔4〕。 Maes〔5〕提出抑郁癥的細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)，認(rèn)為抑郁的發(fā)生可能與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。原花青素(PCA)是天然植物多酚，具有高效抗氧化、抗衰老、抗炎、抗輻射、清除自由基等生物活性〔6〕。本研究以5%右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立小鼠UC動(dòng)物模型，旨在研究PCA對(duì)UC模型小鼠抑郁行為的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 清潔級(jí)雄性健康ICR小鼠，8周齡，體重為20 g左右，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；PCA為紅褐色結(jié)晶性粉末，購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司，純度大于95%；白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體及二抗購(gòu)自上海ProteinTech公司，DSS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2模型制備和實(shí)驗(yàn)分組 24只清潔級(jí)雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(NS)組、模型(UC)組和PCA組，每組8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，UC組和PCA組給予5% DSS自由飲用水7 d，而NS組給予正常飲用水對(duì)照，造模的同時(shí)，PCA組給予75 mg/kg PCA灌胃，1次/d，連續(xù)7 d，其他各組給予等體積生理鹽水代替，在最后一次灌胃后對(duì)各組小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分和行為學(xué)檢測(cè)，處死動(dòng)物，一部分取大腦海馬組織，Western印跡測(cè)定海馬組織IL-6、核因子(NF)-κB蛋白表達(dá)量；另一部分心臟灌注后取腦組織，多聚甲醛固定，待脫水透明，石蠟包埋切片。

1.3DAI的評(píng)估 每日觀察小鼠的體重、隱血情況及大便性狀，進(jìn)行DAI評(píng)分。將體重下降、大便性狀和隱血情況的評(píng)分相加，得出每只小鼠的評(píng)分，用以評(píng)估疾病的活動(dòng)情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：體重減輕(0分，無(wú)減輕；1分，減輕1%～5%；2分，減輕6%～10%；3分，減輕11%～20%；4 分，減輕>20%)；大便性狀(0分，正常；1～2分，松散；3～4分，稀便)；血便(0分，正常；1～2分，輕微出血；3～4分，嚴(yán)重出血)。

1.4小鼠抑郁樣行為研究和標(biāo)本采集

1.4.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST) 小鼠(n=8)于最后一次灌胃后置于透明玻璃圓柱體中(高：45 cm；直徑：19 cm)，水溫 24℃，水深23 cm，待2 min 適應(yīng)時(shí)間，記錄小鼠連續(xù)4 min 不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間是指小鼠在水中放棄掙扎呈漂浮狀態(tài)，或只有細(xì)微的肢體運(yùn)動(dòng)以保持其頭部浮于水面的時(shí)間。

1.4.2懸尾實(shí)驗(yàn)(TST) 最后一次灌胃后，用繩子把動(dòng)物懸吊在離地面40 cm 的高架上，繩子距離尾尖約1 cm。小鼠適應(yīng)2 min 后，記錄小鼠連續(xù)4 min 的不動(dòng)時(shí)間。

1.4.3標(biāo)本采集 測(cè)量完行為學(xué)后，每組4只小鼠立即處死，取小鼠腦組織，在冰上分離出大腦海馬組織，存放于凍存管，-80℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。另外每組4只小鼠，10%水合氯醛按2.5 ml/kg體重腹腔麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，開(kāi)胸暴露心臟，從左心室插入灌注針頭至升主動(dòng)脈，止血鉗固定，剪開(kāi)右心耳，注射器快速推注生理鹽水(室溫)，待血液沖洗干凈后肝臟變白，立即采用輸液裝置滴注多聚甲醛4℃。先快后慢，小鼠四肢肌肉完全僵硬后再維持灌注多聚甲醛。取出結(jié)腸組織置多聚甲醛固定液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋。

1.5Western印跡測(cè)定海馬組織IL-6、NF-κB蛋白表達(dá) 將腦組織中加入裂解液，勻漿后，15 000 r/min、4℃離心15 min，所得上清即為胞質(zhì)蛋白提取液。用4×蛋白處理液配制成等濃度的蛋白樣品，煮沸變性置-20℃冰箱備用。取等量蛋白樣品10%SDS-PAGE分離后，以濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗體孵育后洗膜，顯色后條帶掃描、分析。目的蛋白表達(dá)量以Western印跡中各目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin的比值來(lái)表示。

1.6海馬組織焦油紫染色觀察CA3區(qū)神經(jīng)元損傷 小鼠麻醉后多聚甲醛心臟灌注，快速取腦后置于多聚甲醛固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片機(jī)切片(5 μm)。采用焦油紫染色，37℃下染色15 min，70%酒精分色，二甲苯脫蠟后中性樹(shù)脂封片，觀察并計(jì)數(shù)海馬CA3區(qū)1 mm2區(qū)域中存活的神經(jīng)元。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DAI評(píng)分 UC組小鼠從第3天開(kāi)始出現(xiàn)大便異常，體重下降，第5天大便開(kāi)始潛血陽(yáng)性或者便血，說(shuō)明造模成功。同NS組DAI評(píng)分〔(0.5±0.43)分〕相比，UC組〔(3.6±0.54)分〕明顯增加(P<0.05)；而與UC組相比，PCA組評(píng)分〔(2.2±0.65)明顯降低(P<0.05)。

2.2抑郁樣行為改變 在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，與NS組〔(67.8±12.96)s〕相比，UC組不動(dòng)時(shí)間〔(179.5±20.45)s〕明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，而PCA組不動(dòng)時(shí)間〔(87.1±8.37)s〕明顯低于UC組(P<0.05)。而同樣在懸尾實(shí)驗(yàn)中，與NS組〔(50.1±8.14)s〕相比，UC組不動(dòng)時(shí)間〔(127.5±10.82)s〕明顯延長(zhǎng)，而PCA組不動(dòng)時(shí)間〔(73.6±9.86)s〕明顯低于UC組(P<0.05)。

2.3對(duì)小鼠腦海馬組織中IL-6、NF-κB表達(dá)的影響 與NS組比較，UC組小鼠腦海馬組織中IL-6、NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與UC組相比，PCA組IL-6、NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 PCA對(duì)IL-6、NF-κB/p65蛋白表達(dá)的影響

2.4對(duì)小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)的影響 鏡下可見(jiàn)，NS組〔(157±6.32)個(gè)/mm2〕小鼠CA3區(qū)神經(jīng)元排列整齊、緊密，細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰；與NS組比較，UC組〔(54±4.71)個(gè)/mm2〕小鼠CA3區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)相對(duì)較少(P<0.05)，排列紊亂、疏松，細(xì)胞形態(tài)差，結(jié)構(gòu)不完整，基質(zhì)疏松及空泡形成；而PCA組神經(jīng)元存活數(shù)提高〔(127±4.97)個(gè)/mm2〕，且較UC組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 PCA對(duì)IL-6、NF-κB/p65蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元存活情況(焦油紫染色)

3 討 論

UC是一種嚴(yán)重的腸道疾病。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，UC患者常常合并精神情感障礙，如焦慮和抑郁等，臨床研究也證實(shí)，被診斷為IBD的患者，患焦慮和抑郁的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更高〔7〕，這嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量，甚至危及生命。懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)小鼠抑郁行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，正常小鼠在這兩種實(shí)驗(yàn)中會(huì)表現(xiàn)出不斷掙扎的求生欲，而抑郁的小鼠表現(xiàn)出放棄掙扎的狀態(tài)，從而使不動(dòng)時(shí)間增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明UC小鼠表現(xiàn)出放棄掙扎的抑郁樣行為，而PCA對(duì)這種抑郁樣行為有明顯的改善作用。

關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制目前還不是十分清楚，而Maes〔5〕細(xì)胞因子假說(shuō)的提出，認(rèn)為抑郁癥與細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí)研究也進(jìn)一步證實(shí)了抑郁的患者常伴有免疫激活，表現(xiàn)為促炎性細(xì)胞因子分泌增多，抗炎性細(xì)胞因子分泌減少〔8〕。因此，細(xì)胞因子的表達(dá)改變有可能是抑郁癥發(fā)病的主要原因之一。而以往研究發(fā)現(xiàn)，UC局部強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)可能也與炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放有關(guān)，如IL-6和TNF-α等〔9〕。因此，UC患者常伴抑郁樣的精神情感障礙可能與體內(nèi)炎性細(xì)胞因子分泌的改變有關(guān)。

抗氧化劑的使用已經(jīng)被證明可以減輕急性應(yīng)激反應(yīng)引起的焦慮和抑郁〔10〕。PCA是天然植物多酚，在葡萄籽、紫薯、藍(lán)莓中含量豐富，屬于雙黃酮衍生物的天然多酚化合物。PCA在體外具有清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等活性，對(duì)氧化損傷有良好的防護(hù)作用，國(guó)內(nèi)外對(duì)多種植物中的PCA進(jìn)行了廣泛深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化活性、酶抑制活性、血管保護(hù)活性、抗炎活性、抗腫瘤活性等，對(duì)自由基及機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)有明顯影響。PCA可通過(guò)抑制PKC和NF-κB從而減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙〔11〕。此外，還可通過(guò)降低IL-6、TNF-α表達(dá)，從而降低復(fù)發(fā)性UC大鼠的炎癥反應(yīng)和促進(jìn)受損組織修復(fù)，改善結(jié)腸氧化應(yīng)激〔12〕。

此外，CA3區(qū)海馬神經(jīng)元損傷已被證實(shí)是抑郁癥的主要病理改變〔13〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCA干預(yù)兩周后，可明顯減輕UC小鼠海馬神經(jīng)元的損傷，從而對(duì)神經(jīng)元起到很好的保護(hù)作用。

綜上所述，PCA可能通過(guò)抑制NF-κB的活化，降低IL-6等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，保護(hù)海馬神經(jīng)元的損傷，從而緩解UC小鼠的抑郁樣行為，但確切的作用機(jī)制及作用的時(shí)效性還有待于進(jìn)一步研究。